Po kapitulacji Warszawy (28 września 1939) personel szpitala kontynuował działalność medyczną, prowadzoną w warunkach dużego obciążenia (m.in. przeniesiono do niego w roku 1941 część szpitala św. Ducha, którego budynki zostały zbombardowane). Po kapitulacji miasta ranni polscy żołnierze stali się jeńcami wojennymi, których utrzymanie zgodnie konwencją haską powinna była ponosić III Rzesza. Władze niemieckie uchylały się jednak od płacenia, w związku z czym od października 1939 roku przez kilka miesięcy koszty te ponosiło miasto.
Poza podstawową działalnością medyczną szpital utrzymywał kontakt z Polskim Państwem Podziemnym. W tzw. „Rzeczypospolitej Ujazdowskiej” organizowano szkolenia medyczne lekarzy i pielęgniarek, prowadzono prace badawcze. Edward Loth (prof. UW) zorganizował Zakład Przeszkolenia Inwalidów (uruchomiony w roku 1941) i nowoczesny zakład rehabilitacyjny (jedyną tego rodzaju placówkę w krajach okupowanych). Wydawano fałszywe zaświadczenia o inwalidztwie dla ukrywających się żołnierzy. Pomagano Żydom i innym osobom poszukiwanym przez gestapo. Organizowano pomoc jeńcom sowieckim, których Niemcy umieścili w zachodniej części Ujazdowa, w odrębnym pawilonie obozowym pod strażą, nie zapewniając im podstawowej opieki socjalnej i lekarskiej.