W żelu rozdzielającym następuje rozdział według masy cząsteczkowej.
Aby uwidocznić białka na żelu, najczęściej stosuje się błękit Coomassie lub sole srebra. Rzadziej wykonuje się barwienie fluorescencyjne (głównie barwnikami z grupy SYPRO) czy znakowanie izotopowe.
Elektroforeza dwuwymiarowa thumb|Żel z rozdzielonymi białkami po elektroforezie dwuwymiarowej. Na osi X rozdział względem pI, na osi Y względem masy cząsteczkowej
Elektroforeza dwuwymiarowa (dwukierunkowa) (2-DE) umożliwia rozdział białek zarówno ze względu na ich wielkość, jak i ładunek. Elektroforeza dwukierunkowa może służyć do rozdzielania skomplikowanych mieszanin białek, dzięki niej można rozdzielić ponad 1000 białek do postaci dwuwymiarowej mapy.
W pierwszym etapie białka rozdzielane są na podstawie ich punktu izoelektrycznego przy użyciu techniki ogniskowania izoelektrycznego. Wypadkowy ładunek białka zależny jest od ładunków aminokwasów wchodzących w jego skład. Ze względu na amfoteryczność białek ładunek końcowy zależy od pH roztworu, w którym się znajdują (w pH powyżej pI białko ma ujemny ładunek wypadkowy i wędruje w kierunku anody;