w pH poniżej pI ma dodatni ładunek i migruje w stronę katody). Ładunek wypadkowy nie zależy od wielkości białek. Białko migruje w gradiencie pH do miejsca, w którym pH równe jest jego pI. W miejscu tym białko traci ładunek i staje się nieruchome (ogniskuje). W drugim etapie białka poddaje się rozdziałowi metodą SDS-PAGE w kierunku prostopadłym do użytego w etapie pierwszym.
Do zalet elektroforezy dwukierunkowej należy możliwość obserwacji np. modyfikacji potranslacyjnych, częściowej proteolizy, poziomu ekspresji białek. Do wad należy czasochłonność, brak pełnej automatyzacji, mała powtarzalność i nie zawsze zadowalająca rozdzielczość. Technika ta jest jednak stale ulepszana.
Rozdział kwasów nukleinowych W rozdziale kwasów nukleinowych najczęściej używanymi żelami w elektroforezie jest żel agarozowy i poliakrylamidowy. DNA naładowany jest ujemnie i migruje w stronę elektrody dodatniej. Elektroforezę przeprowadza się do czasu aż marker (zwykle błękit bromofenolowy) przemieści się na drugi koniec żelu. DNA zostaje rozdzielone według wielkości cząsteczek w związku z tym, że większe cząsteczki migrują wolniej od mniejszych. Wpływ ma też kształt i właściwości topologiczne). Kwasy nukleinowe można potem zwizualizować przez dodatek bromku etydyny, który interkaluje między nukleotydami.