W 1507 był on największym okręgiem inkwizytorskim w całej Hiszpanii, obejmując diecezje Burgos, Palencii, Avili, Segowii, Salamanki, Ciudad Rodrigo, Zamory, Astorgi, Leónu, Oviedo, Osmy i częściowo diecezję Calahorra (bez okręgów Guipuzcoa i Vizcaya) oraz opactwa Valladolid, Medina del Campo i Sahagun. W ciągu XVI wieku granice tego obszaru podlegały kilkakrotnie modyfikacjom. W latach 1532–1561 oraz 1567–1574 podlegała mu także Galicja, gdzie jednak ostatecznie utworzono osobny trybunał.
Pod koniec lat 50. XVI wieku Valladolid stało się jednym z głównych (obok Sewilli) ośrodków sympatyków reformacji w Kastylii. Wykryte w 1558 grupy domniemanych luteran zostały potraktowane bardzo surowo. W dwóch ceremoniach auto-da-fé (w maju i październiku 1559) spalonych zostało łącznie dwadzieścia sześć osób. Drugą z tych ceremonii obserwował osobiście król Hiszpanii Filip II Habsburg. Sporadycznie procesy rzekomych sympatyków Marcina Lutra miały miejsce w Valladolid jeszcze do końca lat 80. XVI wieku, ale coraz częściej dotyczyły one cudzoziemców.