Pod koniec XVI wieku główną grupą narażoną na prześladowania byli przesiedleni w głąb kraju z obszarów nadmorskich (Grenada, Walencja) moryskowie, czyli Hiszpanie arabskiego pochodzenia, oskarżeni o potajemne wyznawanie islamu. Na auto-da-fé z kwietnia 1588 piętnastu z czterdziestu czterech oskarżonych było moryskami. Jednakże w latach 1609–1614 społeczność tę wygnano całkowicie z Hiszpanii.
W latach 1601–1606 siedzibę trybunału czasowo przeniesiono do Medina del Campo, które w tych latach stało się stolicą Hiszpanii i siedzibą dworu królewskiego. Z związku z tym trybunał uzyskał wtedy także status „trybunału dworskiego” (przed 1601 i po 1606 status ten miał trybunał w Toledo, a od połowy XVII wieku osobny trybunał w Madrycie).
W XVII i XVIII wieku ponownie głównym celem inkwizytorów z Valladolid stali się marrani, tym razem portugalskiego pochodzenia. Inkwizycja z Valladolid wyróżniała się dużą surowością wobec nich i to niemal do końca pierwszej połowy XVIII wieku.
Trybunał w Valladolid został zniesiony po raz pierwszy w 1808 przez napoleońskiego króla Hiszpanii Józefa Bonaparte. Wojska napoleońskie splądrowały siedzibę trybunału, niszcząc przy okazji jego archiwum.