W 1521 diecezję Calahorry definitywnie wyłączono spod jurysdykcji inkwizycji z Valladolid i również przyłączono do okręgu inkwizycji z Nawarry (sama Calahorra stała się wówczas siedzibą tego trybunału). W 1524 diecezję Ciudad Rodrigo przeniesiono do okręgu inkwizycji z Llereny, a w 1528 okręgi Arenas de San Pedro i Cebreros w diecezji Avili przeszły pod władzę inkwizytorów Toledo. Z drugiej strony jednak, w latach 1532–1561 i 1567–1574 inkwizycji z Valladolid podporządkowany był cały region Galicii, gdzie po dwóch nieudanych próbach (w 1520 i 1561) ostatecznie utworzono osobny trybunał (1574).
Po 1574 inkwizycji z Valladolid podlegał obszar aż 90 tys. km², który obejmował aż 11 diecezji: Burgos, Burgo de Osma, Valladolid, Palencia, Avila, Segovia, Salamanka, Zamora, Astorga, Leon, Oviedo. Mimo dokonanych w poprzednich latach cesji terytorialnych, był to nadal największy pod względem obszaru trybunał na Półwyspie Iberyjskim. Od około połowy XVI wieku zasiadało w nim zawsze trzech inkwizytorów.