Podłoże, które składa się z nicianej siatki, pokrytej warstwą polimeru i węgla, umieszcza się wewnątrz specjalnego urządzenia, w którym znajduje się płynna substancja wykazująca bardzo niskie temperatury wrzenia i bardzo wysokie przewodnictwo cieplne – najczęściej używa się ciekłego etanu (temp. -183 °C) schładzanego przez ciekły azot (temp. −195,8 °C). Próbka w ułamku sekundy jest zamrażana. Istotne, żeby zamrożenie zachodziło tak szybko, ponieważ to umożliwia powstawanie amorficznego lodu, cząsteczki nie ułożą się w krystaliczną strukturę. Ponadto dzięki tak szybkiemu zamrożeniu można otrzymać cząsteczki w ich naturalnej konformacji i orientacji.
Przebieg tworzenia wizualizacji cząsteczki:
zamrożenie preparatu zarejestrowanie setek lub tysięcy zdjęć identyfikacja obrazów cząsteczek znajdujących się na zdjęciach identyfikacja obrazów, w których cząsteczka znajduje się w tej samej orientacji nałożenie na siebie obrazów w celu zwiększenia kontrastu przekształcenie każdej z takich projekcji w model 3D
Problemy występujące przed udoskonaleniem metody CryoEM Niski kontrast Szybkie uszkadzanie próbek przez działanie elektronów Ruch próbek podczas rejestracji danych – próbki wibrowały dodatkowo rozmazując obraz