300px|thumb|right|Preparación robótica de muestras para espectrometría de masas MALDI-TOF
La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas. Las proteínas son componentes esenciales de los organismos vivos, con muchas funciones. El proteoma es el conjunto completo de proteínas que un organismo o sistema produce o modifica. La proteómica permite la identificación de proteínas con sensibilidad, resolución y eficacia crecientes. Estas varían con el tiempo y los distintos requisitos, o presiones, que experimenta una célula u organismo. La proteómica es un dominio interdisciplinario que se ha beneficiado enormemente de la información genética de varios proyectos del genoma, incluido el Proyecto del Genoma Humano. Cubre la exploración de proteomas a partir del nivel general de composición, estructura y actividad de las proteínas. Es un componente importante de la genómica funcional.
La proteómica generalmente se refiere al análisis experimental a gran escala de proteínas y proteomas, pero a menudo se usa específicamente para referirse a la purificación de proteínas y la espectrometría de masas.
Historia y etimología Los primeros estudios de proteínas, que podría considerarse proteómica, comenzaron en 1975, tras la introducción del gel bidimensional y el mapeo de las proteínas de la bacteria Escherichia coli.
La palabra proteoma es un acrónimo de proteína y genoma, y fue acuñada por Marc Wilkins en 1994 cuando era un estudiante Doctoral de la Universidad Macquarie. La Universidad Macquarie también fundó el primer laboratorio dedicado a proteómica en 1995.
Complejidad del problema Después de la genómica y la transcriptómica, la proteómica es el siguiente paso en el estudio de los sistemas biológicos. Es más complicado que la genómica porque el genoma de un organismo es más o menos constante, mientras que los proteomas difieren de una célula a otra y de vez en cuando. Los genes distintos se expresan en diferentes tipos de células, lo que significa que es necesario identificar incluso el conjunto básico de proteínas que se producen en una célula.
En el pasado, este fenómeno se evaluó mediante análisis de ARN, pero se encontró que carece de correlación con el contenido de proteínas. Ahora se sabe que el ARNm no siempre se traduce en proteína, y la cantidad de proteína producida para una determinada cantidad de ARNm depende del gen desde el que se transcribe y del estado fisiológico actual de la célula. La proteómica confirma la presencia de la proteína y proporciona una medida directa de la cantidad presente.
Modificaciones postraduccionales Artículo principal: Post-transcriptional modification
La traducción del ARNm no solo causa diferencias, sino que muchas proteínas también están sujetas a una amplia variedad de modificaciones químicas después de la traducción. Las modificaciones postraduccionales más comunes y ampliamente estudiadas incluyen la fosforilación y la glicosilación. Muchas de estas modificaciones postraduccionales son críticas para la función de la proteína. CCBY
Fosforilación Una de esas modificaciones es la fosforilación, que ocurre con muchas enzimas y proteínas estructurales en el proceso de señalización celular. La adición de un fosfato a aminoácidos particulares, más comúnmente serina y treonina mediada por serina-treonina quinasas, o más raramente tirosina mediada por tirosina quinasas, hace que una proteína se convierta en un objetivo para unirse o interactuar con un conjunto distinto de otras proteínas que reconocen el dominio fosforilado.
Debido a que la fosforilación de proteínas es una de las modificaciones de proteínas más estudiadas, muchos esfuerzos "proteómicos" están orientados a determinar el conjunto de proteínas fosforiladas en una célula o tipo de tejido en particular en circunstancias particulares. Esto alerta al científico sobre las vías de señalización que pueden estar activas en ese caso.
Ubiquitinación La ubiquitina es una pequeña proteína que se puede fijar a ciertos sustratos proteicos mediante enzimas llamadas ubiquitina ligasas E3. Determinar qué proteínas son poliubiquitinadas ayuda a comprender cómo se regulan las vías de las proteínas. Este es, por tanto, un estudio "proteómico" legítimo adicional. De manera similar, una vez que un investigador determina qué sustratos están ubiquitinados por cada ligasa, es útil determinar el conjunto de ligasas expresadas en un tipo celular particular.
Modificaciones adicionales Además de la fosforilación y ubiquitinación, las proteínas pueden someterse a (entre otras) metilación, acetilación, glicosilación, oxidación y nitrosilación. Algunas proteínas sufren todas estas modificaciones, a menudo en combinaciones dependientes del tiempo. Esto ilustra la complejidad potencial de estudiar la estructura y función de las proteínas.
Las proteínas distintas se elaboran en entornos distintos Una célula puede producir diferentes conjuntos de proteínas en diferentes momentos o en diferentes condiciones, por ejemplo, durante el desarrollo, la diferenciación celular, el ciclo celular o la carcinogénesis. Aumentando aún más la complejidad del proteoma, como se mencionó, la mayoría de las proteínas pueden sufrir una amplia gama de modificaciones postraduccionales.
Por lo tanto, un estudio de "proteómica" puede volverse complejo muy rápidamente, incluso si el tema de estudio es restringido. En entornos más ambiciosos, como cuando se busca un biomarcador para un subtipo de cáncer específico, el científico en proteómica podría optar por estudiar múltiples muestras de suero sanguíneo de múltiples pacientes con cáncer para minimizar los factores de confusión y tener en cuenta el ruido experimental. Por tanto, a veces se necesitan diseños experimentales complicados para explicar la complejidad dinámica del proteoma.
Limitaciones de los estudios de genómica y proteómica La proteómica proporciona un nivel de comprensión diferente al de la genómica por muchas razones:
el nivel de transcripción de un gen da solo una estimación aproximada de su nivel de traducción en una proteína. Un ARNm producido en abundancia puede degradarse rápidamente o traducirse de manera ineficaz, dando como resultado una pequeña cantidad de proteína. como se mencionó anteriormente, muchas proteínas experimentan modificaciones postraduccionales que afectan profundamente sus actividades; por ejemplo, algunas proteínas no son activas hasta que se fosforilan. Se utilizan métodos como la fosfoproteómica y la glicoproteómica para estudiar las modificaciones postraduccionales. muchas transcripciones dan lugar a más de una proteína, mediante empalmes alternativos o modificaciones postraduccionales alternativas. muchas proteínas forman complejos con otras proteínas o moléculas de ARN y solo funcionan en presencia de estas otras moléculas. la tasa de degradación de las proteínas juega un papel importante en el contenido de proteínas.
Reproducibilidad. Un factor importante que afecta la reproducibilidad en los experimentos de proteómica es la elución simultánea de muchos más péptidos de los que pueden medir los espectrómetros de masas. Esto provoca diferencias estocásticas entre experimentos debido a la adquisición de péptidos trípticos dependiente de los datos. Aunque los primeros análisis de proteómica shotgun a gran escala mostraron una variabilidad considerable entre los laboratorios, presumiblemente debido en parte a las diferencias técnicas y experimentales entre los laboratorios, la reproducibilidad se ha mejorado en análisis de espectrometría de masas más recientes, particularmente en el nivel de proteínas y el uso de Espectrómetros de masas Orbitrap. En particular, la proteómica dirigida muestra una mayor reproducibilidad y repetibilidad en comparación con los métodos de gunshot, aunque a expensas de la densidad y la eficacia de los datos.
Métodos de estudio de proteínas En proteómica, existen múltiples métodos para estudiar proteínas. Generalmente, las proteínas pueden detectarse mediante el uso de anticuerpos (inmunoensayos) o espectrometría de masas. Si se analiza una muestra biológica compleja, se debe usar un anticuerpo muy específico en el análisis de transferencia de puntos cuantitativos (QDB) o se debe usar una separación bioquímica antes del paso de detección, ya que hay demasiados analitos en la muestra para realizar detección y cuantificación precisas.
Detección de proteínas con anticuerpos (inmunoensayos) Los anticuerpos contra proteínas particulares, o sus formas modificadas, se han utilizado en estudios de bioquímica y biología celular. Estas se encuentran entre las herramientas más comunes utilizadas por los biólogos moleculares en la actualidad. Existen varias técnicas y protocolos específicos que utilizan anticuerpos para la detección de proteínas. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se ha utilizado durante décadas para detectar y medir cuantitativamente proteínas en muestras. El western blot puede usarse para la detección y cuantificación de proteínas individuales, donde en un paso inicial, una mezcla de proteínas compleja se separa usando SDS-PAGE y luego la proteína de interés se identifica usando un anticuerpo.
Las proteínas modificadas se pueden estudiar desarrollando un anticuerpo específico para esa modificación. Por ejemplo, existen anticuerpos que solo reconocen ciertas proteínas cuando están fosforiladas en tirosina, se conocen como anticuerpos fosfoespecíficos. Además, existen anticuerpos específicos para otras modificaciones. Estos pueden usarse para determinar el conjunto de proteínas que han sufrido la modificación de interés.
La detección de enfermedades a nivel molecular está impulsando la revolución emergente de diagnósticos y tratamientos precoces. Un desafío al que se enfrenta el campo es que los biomarcadores de proteínas para el diagnóstico temprano pueden estar presentes en muy poca abundancia. El límite inferior de detección con la tecnología de inmunoensayo convencional es el rango femtomolar superior ( M). La tecnología de inmunoensayo digital ha mejorado la sensibilidad de detección en tres registros, hasta el rango attomolar ( M). Esta capacidad tiene el potencial de abrir nuevos avances en el diagnóstico y la terapéutica, pero estas tecnologías se han relegado a procedimientos manuales que no son adecuados para un uso rutinario eficiente.
Detección de proteínas sin anticuerpos Si bien la detección de proteínas con anticuerpos sigue siendo muy común en biología molecular, también se han desarrollado otros métodos que no se basan en un anticuerpo. Estos métodos ofrecen varias ventajas, por ejemplo, a menudo pueden determinar la secuencia de una proteína o péptido, pueden tener un rendimiento mayor que los basados en anticuerpos y, a veces, pueden identificar y cuantificar proteínas para las que no existen anticuerpos.
Métodos de detección Uno de los primeros métodos para el análisis de proteínas ha sido la degradación de Edman (introducida en 1967) en la que un solo péptido se somete a múltiples pasos de degradación química para resolver su secuencia. Estos primeros métodos han sido reemplazados principalmente por tecnologías que ofrecen un mayor rendimiento.
Los métodos implementados más recientemente utilizan técnicas basadas en espectrometría de masas, un desarrollo que fue posible gracias al descubrimiento de métodos de "ionización suave" desarrollados en la década de 1980, como la desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI) y la ionización por electrospray (ESI). Estos métodos dieron lugar a los flujos de trabajo de proteómica de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba, donde a menudo se realiza una separación adicional antes del análisis (ver más abajo).
Métodos de separación