Il existe de nombreuses méthodes d'investigation des interactions protéine–protéine. Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients, en particulier pour ce qui concerne la sensibilité et la spécificité. Une haute sensibilité signifie que beaucoup des interactions qui existent seront détectées, alors qu'une haute spécificité veut dire que la plupart des interactions détectées existent vraiment.
Méthodes biochimiques
La co-immunoprécipitation est la méthode de choix d'analyse des interactions protéine-protéine, en particulier quand elle est conduite avec des protéines endogènes. La protéine à étudier est isolée avec un anticorps spécifique. Les différents acteurs de l'interaction qui sont accrochés à cette protéine sont ensuite identifiés par transfert de protéines (Western blot) Golemis E. (2002), Protein-protein interactions : A molecular cloning manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ix, 682. Les interactions détectées de cette manière sont considérées comme étant vraies. Cependant cette méthode ne peut être utilisée que pour vérifier des éléments dont on suppose déjà la présence ; elle ne permet donc pas le criblage. Il faut également noter que l'immunoprécipitation révèle à la fois des interactions directes et indirectes. Donc, un résultat positif indique que deux protéines interagissent directement ou par l'intermédiaire de un ou plusieurs pontages moléculaires. Ceci inclut des pontages de protéines, d'acides nucléiques (ADN ou ARN), ou d'autres molécules. La bimolecular fluorescence complementationLa bimolecular fluorescence complementation est une technique généralement utilisée pour valider des interactions protéiques. Elle fonctionne par association de fragments protéiques fluorescents qui sont accrochés aux composants du même système macromoléculaire. (BiFC) est une nouvelle technique d'observation des interactions protéiques. En association avec d'autres techniques récentes, cette méthode peut être utilisée pour le criblage des interactions protéine-protéine et de leurs régulateurs , DERBLa Dual expression recombinase based (DERB) à simple vecteur est une méthode de clonage et de sous-clonage efficace des vecteurs plasmidiques pour le criblage à haut débit et la vérification des interactions protéine-protéine à l'intérieur de la cellule vivante. La DERB a été mise au point par Lu JP et al. . L'électrophorèse par affinitéL'électrophorèse par affinité est utilisée pour séparer et caractériser des biomolécules d'après leurs caractéristiques moléculaires par leur accrochage à une autre biomolécule. (affinity electrophoresis) est employée pour l'estimation des constantes d'association, comme l'électrophorèse par affinité de la lectine ou la description de molécules avec des caractéristiques particulières comme le glycane ou encore le couplage des ligands. Les analyses pull-down (pull-down assays) sont une variation classique de l'immunoprécipitation et de l'immunoélectrophorèse et sont utilisées de la même façon quoique cette approche se prête mieux à un premier tri pour les interactions protéiques. Le label transfert peut être employé pour le criblage ou la confirmation d'interactions protéiques et peut fournir des informations sur l'interface sur laquelle les interactions ont lieu. Le label transfert peut aussi détecter des interactions faibles ou transitoires qu'il serait difficile d'obtenir en utilisant une autre stratégie in vitro. Au cours d'un label transfert une protéine connue est marquée avec un marqueur détectable. Le marqueur est ensuite transféré sur une protéine de l'interaction qui peut alors être identifiée grâce à lui. Le double hybride permet d'observer l'interaction entre des protéines hybrides. Cette méthode permet d'identifier les éléments associés à une protéine de manière impartiale. Le phage display est une technique de laboratoire qui permet d'étudier les interactions protéine-protéine, protéine-peptide et protéine-ADN en utilisant des bactériophages pour rattacher les protéines aux informations génétiques qui les encodent. Le phage display est utilisé pour le criblage à haut débit. La réticulation in-vivo de complexes protéiques, utilisant des analogues artificiels d'acides aminés naturels pour la réticulation de ces complexes, a été présentée en 2005 par les chercheurs de l'institut Max Planck . Avec cette technique, les cellules sont cultivées avec de la diazirine, analogue de la leucine et de la méthionine, qui est incorporée aux protéines. Les diazirines sont activées sous la lumière ultraviolette et se lient aux protéines interactives qui se trouvent à l'intérieur de quelques ångströms d'analogue de l'acide aminé photosensible. La méthode TAP (pour Tandem affinity purification) permet l'identification à haut débit des interactions protéiques. Par opposition à l'approche du double-hybride, la précision de la méthode peut soutenir la comparaison avec celles des expérimentations à petite échelle et les interactions sont détectées dans le bon environnement cellulaire comme dans le cas de la co-immunoprécipitation. Cependant, la méthode TAP nécessite deux purifications successives des protéines et, par conséquent, ne peut pas détecter les interactions protéine-protéine transitoires. Récemment des expérimentations par la méthode TAP ont été conduites sur tout le génome par Krogan et al. et Gavin et al. permettant de mettre à jour les données sur les levures . La réticulation chimique est souvent employée pour « fixer » les interactions protéiques en place avant d'essayer d'isoler/identifier les protéines qui interagissent. La réticulation chimique, suivie d'une spectrométrie de masse par désorption-ionisation laser assistée par matrice, peut être utilisée pour analyser des interactions protéiques en place avant d'essayer d'isoler/identifier les protéines qui interagissent. Cette méthode détecte des interactions parmi des protéines non marquées et est disponible chez CovalX AG est une société suisse située à Zurich qui conçoit et produit des instruments scientifiques pour l'industrie et la recherche.. La SPINE (Strepprotein interaction experiment) qui utilise une combinaison de réticulations réversibles avec du méthanal et l'incorporation d'un marqueur d'affinité pour détecter in vivo les acteurs de l'interaction. La QUICK (Quantitative immunoprecipitation combined with knock-down) se fonde sur la co-immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative SILAC (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture) et l'interférence par ARN. Cette méthode détecte des interactions parmi des protéines endogènes non marquées . Cette technique est donc autant digne de confiance que la co-immunoprécipitation, bien qu'elle dépende de la disponibilité des anticorps convenables. La PLA () in situ est une méthode immunohistochimique utilisant des sondes pour la détection des protéines, pour les interactions protéiques et les modifications. Chaque sonde PLA est fournie avec un court fragment d'ADN qui lui est attaché et lié soit avec les espèces spécifiques d'anticorps primaires, soit consiste en des anticorps primaires à ADN marqué directement Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat. Methods. 3 décembre 2006 ; 3(12):995–1000. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius KJ, Andersson AC, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, Ostman A, Landegren U, Söderberg O. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol. Cell Proteomics, 6 septembre 2007 ; 6(9):1500-9.. Lorsque les sondes PLA sont très proches, les fragments d'ADN peuvent interagir par l'addition ultérieure de deux autres oligonucléotides d'ADN. Après l'assemblage des deux oligonucléotides par ligature enzymatique, elles sont amplifiées à l'aide d'une polymérase. Après la réaction d'amplification, plusieurs centaines de réplications du cercle d'ADN ont eu lieu et des sondes complémentaires d'oligonucléotide avec un fluorophore ou une enzyme marquée mettent le produit en évidence. La forte concentration de la fluorescence ou du signal chromogénique dans chaque molécule particulière du produit amplifié est facilement visible comme une tache brillante distincte sous le microscope à fluorescence ou sous un microscope standard à champ clair.
Méthodes biophysiques et théoriques
La Bio-Layer Interferometry est une technique sans marqueurs pour mesurer les interactions biomoléculaires Label-free Optical Biosensors in Drug Discovery. Fang, Y. Trends in Biopharmaceutical Industry, 2007, 3, 34–38 Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Rich, R. L.; Myszka, D. G. Analytical Biochemistry, 2007, 361, 1–6 protéine-protéine ou protéine-molécule de petite dimension. C'est une technique analytique optique qui analyse la configuration des interférences d'une lumière blanche réfléchie par deux surfaces : une couche de protéine immobilisée sur la pointe d'un biocapteur et une couche de référence interne. Chaque changement du nombre de molécules liées au biocapteur crée un décalage dans la configuration des interférences qui peut être mesuré en temps réel et fournit des indications détaillées sur la cinétique de l'association-dissociation des deux molécules aussi bien que sur la constante d'affinité de l'interaction protéique (ka, kd et KD). En raison de la configuration du capteur la technique se prête particulièrement bien à l'étude d'échantillons purifiés ou bruts aussi bien qu'au criblage à haut débit. La méthode de détection peut également être utilisée pour déterminer la concentration molaire des échantillons à analyser. La bio-layer interferometry a été mise au point par les fondateurs de la société ForteBio qui fabrique du matériel de laboratoire pour l'analyse. La dual polarisation interferometry (interférométrie par double polarisation) ou DPILa Dual polarization interferometry (DPI) est une méthode d'analyse qui sonde des couches à l'échelle moléculaire adsorbées à la surface d'un guide d'ondes en utilisant l'onde évanescente d'un rayon laser confiné dans le guide d'ondes., peut être employée pour mesurer les interactions protéine-protéine. La DPI autorise des mesures en haute résolution de la taille moléculaire, de la densité et de la masse en temps réel. Comme le marquage n'est pas nécessaire, un des types de protéine peut être immobilisé sur la surface d'un guide d'ondes. On peut également faire des mesures quantitatives de la cinétique et de l'affinité en cours d'interaction, aussi bien que des changements configurationnels. La diffusion statique de la lumièreLa diffusion statique de la lumière est une technique de chimie physique qui mesure l'intensité de la lumière diffusée pour obtenir le poids moyen moléculaire d'une macromolécule comme un polymère ou une protéine. (SLS) mesure les variations de la diffusion Rayleigh des complexes protéiques en solution et peut également caractériser de façon non destructive les interactions faibles et fortes sans marquage ou immobilisation de la protéine. La mesure consiste à mélanger une série d'aliquotes de différentes concentrations ou compositions avec l'analyte, de mesurer les variations de la diffusion de la lumière résultant de l'interaction et de faire correspondre les variations de diffusion avec la concentration à un modèle de référence. Les interactions faibles, non spécifiques, sont généralement caractérisées par le second coefficient du viriel. Ce type d'analyse peut déterminer l'équilibre de la constante d'association pour des associations de complexes .