thumb|right|Martin Luther, père de la Réforme.
À Besançon, la Réforme protestante est une manifestation confessionnelle et sociale majeure dans l'histoire de la ville. Durant une période comprise entre 1520 et 1540, cette vision émerge et se développe fortement grâce à plusieurs prédicateurs notoires, en particulier les théologiens Guillaume Farel et Théodore de Bèze. Les habitants, pourtant réputés conservateurs, embrassent de plus en plus nombreux la nouvelle cause, entraînant les pauvres d'abord, puis les gens de métiers, et les notables. Alors que la principauté de Montbéliard et la Suisse voisines s'y conforment définitivement, localement le camp jugé hérétique est violemment confronté avec le catholicisme toujours religion d'État. Les Autorités mènent une répression impitoyable, jusqu'à l'élimination définitive de la menace durant la surprise de 1575. Dès lors, pendant plus de deux siècles, la communauté est inexistante, situation qui perdurera jusqu'à la Révolution. Le gain de popularité locale du luthéranisme, la gravité des troubles engendrés allant jusqu'à une bataille armée, et la position stratégique de la cité, font de cet épisode l'un des plus notables en la matière, à l'instar de la république de Mulhouse ou de La Rochelle.
Naissance et développement Prémices et avènement Dans les années 1520, le chapitre catholique de Besançon enregistre officiellement l'existence de la Réforme dans ses acta capituli (« actes du chapitre »). Simultanément, il lance des actions préventives ou punitives contre les protestants communément désignés sous le terme péjoratif d'hérétiquesLa vie religieuse à Besançon, du à 2010, page 84.. Il est fait mention de mesures contra Lutheri en 1523 et contre les Paysans (en référence à la guerre des Paysans allemands) en 1525. En outre, il est interdit de parler aux luthériens dans la cité vers 1527La vie religieuse à Besançon, du à 2010, page 85., et l'empereur émet un mandement défensif en 1527 pour la Franche-Comté. Ces décisions se soldent les années suivantes par une résistance concrète des Réformés, notamment lorsque Nicolas Perrenot de Granvelle fait exécuter préventivement un religieux, le moine Coquillard de Reims, suspecté en 1528 d'être un Réformé, de même qu'un certain Lambellin. Dans le même temps, Gauthiot d'Ancier est banniJean Defrasne, Histoire d'une ville, Besançon : le temps retrouvé, Cêtre, 1990, page 28.. Néanmoins l'interdiction faite aux protestants en 1527 de fréquenter Besançon est levée le , sous la pression de certains notables de la ville. On note à la même période l’exécution d'un luthérien dont on éparpille les restes coupés en morceaux à travers la ville. De nombreuses processions, prières collectives de rues et prêches publics sont également ordonnés afin de conserver la foi catholique. En 1535, des maîtres d'école, des médecins, des humanistes sont poursuivis par des moines sous l'appellation « érasmiens ou mal sentants de la foy » ou même encore « lecteurs de mauvais livres. » En fait, les Autorités mettent tout en œuvre pour éviter une situation « similaire à l'Allemagne » : menaces de saisie de biens et d'arrestation contre les individus qui tenteraient de dépénaliser l'hérésie. Ces mesures coercitives vaudront à la Municipalité des éloges de Charles Quint et de Marie-Thérèse d'Autriche, respectivement en 1534 et en 1537M. Richard, Histoire des diocèses de Besançon et de Saint-Claude tome II, librairie Cornu, 1851, pages 202 à 258..
En 1537, l'archevêque Antoine Ier de Vergy accentue sans répit le combat contre la Réforme. De sa propre autorité, il interdit formellement de fréquenter des protestants ou d'en avoir comme domestiques, et il emprisonne les prédicateurs protestants. Ses successeurs lui emboîtent le pas jusqu'à « la surprise de Besançon » en 1575. Le Comté de Montbéliard bascule dans la Réforme notamment avec l'évangélisation de Guillaume Farel et de ses acolytes malgré l'opposition bisontine qui envoie plusieurs émissaires sur place et dote de moyens appropriés les églises catholiques locales, contribuant ainsi à transformer la ville en bastion. Nombre d'exécutions capitales sont ordonnées à Besançon : un registre mentionne « Quentin Bussi, un Français, Pierre de Pradines, un Voyageur, deux curés de Saint-Amour, Jean Bobet, Étienne Servat, Louis Conot, un domestique, ainsi que Jean le Nid - libraire de Dole ». D'autres mesures sont prises contre les protestants étrangers découverts dans la cité. Le premier monétaire de Besançon, Pierre Duchemin, parvient à s'enfuir en 1537, alors que les autorités avaient retrouvé chez lui une Bible traduite en français, le premier des quatre exemplaires du genre publiés à Neuchâtel en 1535 par Pierre de Vingle, connu sous le nom de Bible d'Olivetan. Mais le protestantisme commence réellement à trouver un écho très favorable près des populations à partir de 1538 malgré la répression, lorsque les théologiens Guillaume Farel, Théodore de BèzeÉmile Haag, La France protestante ou vies des protestants français qui se sont fait un nom dans l'histoire […], Cherbuliez, 1847, page 91., voire Jean Calvin selon certaines sourcesBulletin de la Société de l'histoire du protestantisme français, Agence centrale de la Société, 1861, pages 9, 10 et 11., viennent prêcher dans la ville, jusqu'en 1541 pour le premier, dans une maison à l'angle de la rue de la Vieille-MonnaieQuand Besançon se donne à lire : essais en anthropologie urbaine, page 55.Alphonse Delacroix, Guide de l'étranger à Besançon et en Franche-Comté, 1860.. En 1539, une grande partie des chanoines de Montbéliard se retirent de la ville chassés par le protestantisme triomphant qui célèbre le culte dans toutes les églises. Leur arrivée à Besançon provoque le trouble et la perplexité des autorités locales rendues inquiètes par la soudaineté et l'ampleur de l'événement.
thumb|left|Guillaume Farel, célèbre prédicateur calviniste qui prêcha à Montbéliard en 1524-1525, puis à Besançon vers 1540.
Expansion et premiers incidents Bien que la ville continue à célébrer le culte catholique romain, les Bisontins très proches de la Suisse et de la Principauté de Montbéliard s'intéressent de plus en plus aux nouveaux dogmes et finissent par pencher du côté de la Réforme. La communauté protestante mène alors une campagne féroce contre les dirigeants de l'Église et en particulier contre de Vergy. Les gouverneurs catholiques de la commune se montrent au début assez tolérants. Des attentats iconoclastes sont perpétrés : des statues de la Vierge sont vandalisées et d'autres de saints, mutilées ; des verrières de la cathédrale Saint-Jean sont brisées. Moins violemment, des chorales populaires se rassemblent en 1561 à ChamarsQuand Besançon se donne à lire : essais en anthropologie urbaine, page 56. sous la protection d'arquebuses pour y entonner les psaumes de Théodore de Bèze et de Clément Marot. On assiste aussi à des manifestations publiques véhémentes et même à la lapidation de prêtres. Le décède Antoine de Vergy. Son successeur Pierre de La Baume, évêque de Genève transféré par le pape à Besançon, poursuit la lutte engagée contre l'hérésie. Un moment hésitant, il fait un discours éloquent lors de son investiture dans l'église Saint-Pierre de Besançon où il demande à la foule si elle le reconnaît pour archevêque. La réponse lui étant unanimement favorable, il est désigné comme « protecteur de la foi ». Fort de cette confiance, les autorités ecclésiastiques font arrêter les protestants les plus en vue de la ville. En outre, on fait publier un décret d'excommunication contre toute personne soupçonnée d'hérésie. Au printemps 1543, deux prêcheurs nommés Marin Mantel et Crespin Petit organisent la communauté et rallient une partie de la population à leur cause. En 1544, à la suite du décès de Pierre de la Baume, le grand vicaire François Bonvalot est élu par le chapitre pour assurer l'intérim en attendant que le successeur désigné évêque coadjuteur par Pierre de la Baume, son neveu Claude de La Baume âgé de sept ans, ait atteint sa majorité. Après plusieurs luttes intestines entre les partisans et les adversaires du nouvel archevêque à propos de sa légitimité, les autorités finissent par se mettre d'accord. François Bonvalot assure l'administration du diocèse en attendant que Claude de La Baume soit approuvé par le pape et l'empereur. La restauration radicale du dogme catholique et plus généralement la poursuite de la lutte antiprotestante peut donc reprendre sans être empêchées. Il faut cependant attendre que Claude de la Baume ait accédé au siège épiscopal annoncé le , avec effet presque trois ans plus tard, pour envisager une totale cohésion. Claude se révèle très combatif. Avant même que les décrets du concile de Trente ne soient officiellement signés, il se montre acharné à les faire appliquer au niveau local.
Le massacre de Wassy en 1562 marque le début des guerres de religion, véritable guerre civile qui ravage le royaume de France. La cité de Besançon est alors une République indépendante protégée par le Saint-Empire romain germanique, de ce fait relativement épargnée au début du conflit. Le roi Philippe II demande à Marguerite de Parme de se hâter de faire appliquer le concile de Trente pour la Franche-Comté. Elle commence par consulter le gouverneur et le Parlement de la région afin de faire respecter au mieux les mesures préconisées. Les luttes font rage au sein de la ville : deux conceptions du catholicisme s'affrontent sans cesser de tenter d'éradiquer la Réforme ; d'un côté l'archevêque et la hiérarchie ecclésiastique soucieuse de conserver ses privilèges ; de l'autre le Magistrat responsable de la Commune, allié de longue date avec des localités suisses passées au protestantisme, bien qu'il se fût déclaré hostile à toute conversion. Ajouter à cela des dissensions internes au sein même de l'Église catholique sur des questions de successions, de propriété, d'application du dogme et du Concile. L'Empereur et/ou ses représentants, désireux que le catholicisme triomphe en ses terres, essaie de les réconcilier pour que les coups ne frappent que les seuls hérétiques. Quant aux quatorze co-gouverneurs de la ville, ils n'osent aucune répression, au risque de perdre une partie importante de leurs électeurs, allant parfois jusqu'à exercer des représailles sur leurs amis et leur famille. Après des discussions longues et innombrables, l'ensemble des protagonistes arrivent finalement à trouver un accord de fond et décident d'appliquer à la lettre l'ensemble des mesures conciliaires. Cependant les événements ont occasionné de tels troubles que la confusion a provoqué un retournement sensible dans une ville devenue majoritairement protestante avec l'arrivée, en 1568 de nombreux Réformés de France chassés par la guerre. Nombre de Bisontins promettent allégeance au nouveau dogme. Alors qu'au début le culte touche essentiellement les couches les plus pauvres de la société, mendiants et vagabonds qui n'ont rien à perdre à adopter la nouvelle foi, la Réforme gagne les gens de métiers et particulièrement les marchands et commerçants, ainsi que les adeptes de la démocratie à commencer par les membres de la faction de Gauthiot d'Arcier.