La précipitation des protéines est un ensemble de techniques largement utilisées lors du traitement en aval (purification) des produits biologiques, afin de concentrer les protéines et de les séparer de divers contaminants. Dans l'industrie biotechnologique, elle sert par exemple à éliminer des contaminants présents dans le sang. Son principe consiste à modifier le pouvoir solvatant du solvant, le plus souvent en abaissant la solubilité du soluté par l'ajout d'un réactif.
Principe physico-chimique Solubilité des protéines La solubilité des protéines dans un tampon aqueux dépend de la répartition des résidus d'acides aminés hydrophiles et hydrophobes à la surface de la protéine. Les résidus hydrophobes se trouvent majoritairement dans le cœur des protéines globulaires, mais certains forment des îlots en surface. Une protéine présentant une forte proportion de résidus hydrophobes en surface possède une faible solubilité en milieu aqueux, tandis que les résidus chargés et polaires interagissent avec les groupes ioniques du solvant et augmentent la solubilité.
Lorsqu'une protéine est dissoute dans une solution d'électrolyte ou dans l'eau, des forces électrostatiques répulsives se forment entre les molécules et limitent leur agrégation. Les contre-ions du solvant migrent vers les résidus chargés de la surface et constituent une couche de solvatation, à laquelle s'ajoute une couche d'hydratation autour des résidus hydrophiles. Ces couches réduisent les interactions entre protéines et la probabilité d'agrégation. À l'inverse, des forces attractives (interactions dipolaires, interactions entre résidus basiques et acides de protéines voisines) tendent à les rapprocher. Pour provoquer la précipitation, les réactifs ajoutés visent donc à réduire la couche d'hydratation entourant la protéine.
Formation du précipité La formation d'un précipité protéique se déroule par étapes. Un agent précipitant est d'abord ajouté sous agitation régulière, ce qui favorise les collisions entre le précipitant et les protéines. Survient ensuite une phase de nucléation, au cours de laquelle se forment des agrégats submicroscopiques dont la croissance est gouvernée par la diffusion brownienne. Une fois une taille critique atteinte (de l'ordre de 0,1 à 10 µm selon l'intensité du cisaillement), les particules continuent de grossir en se heurtant et en floculant. Lors de l'étape finale, dite de vieillissement sous cisaillement, les particules se heurtent, s'agrègent puis se fragmentent jusqu'à atteindre une taille moyenne stable, propre à chaque protéine. La résistance mécanique des particules est liée au produit de la vitesse de cisaillement moyenne et du temps de vieillissement, appelé nombre de Camp.
Méthodes Relargage Le relargage (en anglais salting out) est la méthode la plus courante. L'ajout d'un sel neutre, comme le sulfate d'ammonium, comprime la couche de solvatation et accroît les interactions entre protéines : les charges de surface interagissent avec le sel plutôt qu'avec l'eau, ce qui expose les îlots hydrophobes et fait précipiter la protéine.
Le relargage est un processus spontané lorsque la concentration en sel adéquate est atteinte. Le retour des molécules d'eau de la couche de solvatation vers la solution accroît fortement leur entropie : l'enthalpie libre (énergie de Gibbs) de la transformation devient négative et la précipitation se produit spontanément. L'efficacité des sels suit la série de Hofmeister : les sels dits cosmotropes favorisent l'agrégation, tandis que les sels chaotropes ont l'effet inverse. La diminution de la solubilité en fonction de la force ionique peut être décrite par l'équation de Cohn. Le sulfate d'ammonium est le sel le plus employé car il est peu coûteux, peu sensible à la température entre 0 et 30 °C et non polluant ; les précipités conservés dans la solution saline peuvent rester stables pendant des années, à l'abri de la protéolyse et des contaminations bactériennes.
Précipitation au point isoélectrique Le point isoélectrique (pI) est le pH pour lequel la charge nette de la protéine est nulle. À ce pH, les forces électrostatiques répulsives disparaissent et les forces attractives provoquent l'agrégation puis la précipitation. Le pI de la plupart des protéines se situe entre 4 et 6. Des acides minéraux, tels que l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique, servent d'agents précipitants. L'inconvénient principal est la dénaturation irréversible provoquée par ces acides, si bien que cette méthode est surtout utilisée pour précipiter les protéines contaminantes plutôt que la protéine cible. La précipitation de la caséine lors de la fabrication du fromage ou de la production de caséinate de sodium est une précipitation isoélectrique.
Précipitaion avec des solvants organiques miscibles L'ajout de solvants miscibles comme l'éthanol ou le méthanol peut faire précipiter les protéines. Le solvant organique déplace progressivement l'eau de la surface de la protéine, réduit la couche de solvatation et abaisse la constante diélectrique du milieu, ce qui permet aux protéines de se rapprocher et de s'agréger. La température doit être maintenue en dessous de 0 °C pour éviter la dénaturation. Le procédé Cohn de fractionnement des protéines plasmatiques repose sur une précipitation à l'éthanol pour isoler les différentes protéines du plasma. En biologie clinique, le méthanol est par ailleurs employé comme agent précipitant lors du dosage de la bilirubine.
Polymères non ioniques Des polymères tels que les dextrans et les polyéthylène glycols (PEG) sont fréquemment utilisés car ils sont peu inflammables et dénaturent moins les biomatériaux que la précipitation isoélectrique. En solution, ils attirent les molécules d'eau hors de la couche de solvatation, ce qui renforce les interactions entre protéines et favorise la précipitation. Dans le cas du polyéthylène glycol, la précipitation peut être modélisée à partir de la concentration en polymère et de coefficients d'interaction protéine-protéine et protéine-polymère.
Floculation avec des polyélectrolytes L'alginate, la carboxyméthylcellulose, l'acide polyacrylique, l'acide tannique et les polyphosphates peuvent former des réseaux étendus entre les molécules de protéines. L'efficacité de ces polyélectrolytes dépend du pH : les polyélectrolytes anioniques s'emploient à un pH inférieur au point isoélectrique, les cationiques à un pH supérieur. Un excès de polyélectrolyte peut redissoudre le précipité. L'élimination du trouble protéique du moût de bière à l'aide de la mousse d'Irlande (Chondrus crispus) est un exemple de floculation par polyélectrolyte.
Sels métalliques À faible concentration, des sels métalliques permettent de précipiter des enzymes et des acides nucléiques. Les ions métalliques polyvalents fréquemment utilisés sont Ca, Mg, Mn ou Fe.
Mise en œuvre industrielle Plusieurs types de réacteurs permettent de précipiter de grandes quantités de protéines, par exemple des ADN polymérases recombinantes. Le réacteur discontinu (batch) est le plus simple : l'agent précipitant est ajouté lentement sous agitation, ce qui produit des particules compactes et mécaniquement stables. Dans le réacteur tubulaire, la solution protéique et le réactif sont mis en contact dans une zone de mélange efficace puis circulent dans de longs tubes où s'opère la précipitation, en s'approchant d'un écoulement piston ; ce réacteur, sans pièce mécanique mobile, est peu coûteux mais peut devenir très long si l'agrégation est lente. Le réacteur parfaitement agité continu (RPAC) fonctionne en régime permanent, la solution fraîche entrant en contact avec une suspension contenant déjà des particules de précipité et les réactifs.
Notes et références
Articles connexes Purification des protéines Relargage Point isoélectrique Procédé Cohn Série de Hofmeister Sulfate d'ammonium
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