La toxine botulique (ou botulinique, souvent désignée par le nom de marque lexicalisé botox) est une toxine sécrétée par Clostridium botulinum, la bactérie responsable du botulisme (toxi-infection alimentaire généralement contractée lors de la consommation de conserves avariées et responsable de paralysies musculaires). Il s'agit d'une protéine dont les propriétés neurotoxiques en font le plus puissant poison connu avec une DL50 estimée chez l'humain de l'ordre de 1 à . La toxine est thermolabile mais résistante aux acides et aux sucs digestifs.
Ses propriétés en font une arme biologique (toxine en aérosols), et à très faible dose un produit thérapeutique ou cosmétique.
Différents types de toxines botuliques
Sont distingués huit types de qui diffèrent par les propriétés antigéniques des toxines qu'elles produisent : A, B, C1, C2, D, E, F et G. Ces huit toxinotypes sont associés à des protéines non toxiques (ANTPs) Stéphanie Raffestina, Jean Christophe Marvauda, Rosario Cerratoa, Bruno Dupuyb, Michel R. Popoff, « Organization and regulation of the neurotoxin genes in and », Anaerobe, 2004 (10), 93-100.. Le botulisme humain est associé aux types A, B et E et exceptionnellement aux types C et F alors que les types C et D sont essentiellement responsables du botulisme animal. Le botulisme de type A est le plus grave et est souvent mortel car la toxine correspondante est la plus active de toutes les toxines. Le type G a été retrouvé uniquement dans le sol Miia Lindström and Hannu Korkeala, « Laboratory Diagnostics of Botulism », Clinical Microbiology Reviews, 2006 (19), 298-314.. Le type H découvert récemment est le plus meurtrier de tous et sa séquence est gardée secrète le temps de trouver un possible remède, le risque d'un détournement de la toxine étant trop élevé.
D'après leurs caractères phénotypiques, les souches de sont distinguées en quatre groupes : les souches du groupe sont protéolytiques et elles peuvent produire une toxine de type A, B ou F ou un mélange de toxines (A+B, A+F ou B+F) ; les souches du groupe sont non protéolytiques et elles peuvent produire une toxine de type B, E ou F ; les souches du groupe sont non protéolytiques et elles peuvent produire une toxine de type C ou D ; les souches du groupe sont protéolytiques, elles peuvent produire une toxine de type G.
Activité pharmacologique
La toxine botulique inhibe la libération de l'acétylcholine au niveau de la plaque motrice et au niveau du système nerveux parasympathique. Elle agit par paralysie des nerfs moteurs et provoque une paralysie flasque.
En temps normal, une cellule musculaire (myocyte) est stimulée lorsqu'elle reçoit un signal. Ce signal est transmis sous la forme d'un potentiel d'action qui migre le long d'un neurone : on parle d'influx nerveux. Au niveau de la synapse nerveuse, des vésicules d'acétylcholine fusionnent avec la membrane du neurone pour relâcher des molécules d'acétylcholine dans le milieu. Les cellules musculaires entrent en contraction tant que ces récepteurs membranaires reçoivent des molécules d'acétylcholine.
La toxine botulique agit au niveau de la fusion des vésicules d'acétylcholine avec la membrane de la cellule nerveuse en agissant sur le complexe SNARE. Le complexe SNARE permet la fusion entre la vésicule et la membrane pré-synaptique. Ainsi les récepteurs à acétylcholine des cellules musculaires restent vides et les muscles n'entrent pas en contraction. Ceci explique le phénomène de paralysie flasque observé chez les patients atteints de botulisme.
La toxine botulique est l'un des poisons les plus violents connus à ce jour. La DL a été évaluée à Diane O. Fleming et Debra Long Hunt, Biological Safety: principles and practices, ASM Press, 2000, . : estimée chez l'humain entre 1,3 et par voie intraveineuse ou intramusculaire et entre 10 et par inhalation. (soit plus de inférieure à celle du cyanure et plus de inférieure à celle du gaz VX). La toxine est thermolabile mais résistante aux acides et aux sucs digestifs.
Un milligramme de toxine pure suffirait à causer la mort de trente à quarante millions de souris, soit une masse d'environ .
Structure de la toxine botulique
Structure générale
La toxine est un polypeptide à deux chaînes, une lourde (H : ) et une légère (L : ). La chaîne lourde de est liée à une chaîne légère de par un pont disulfure. La chaîne lourde lie la molécule de toxine sur le récepteur neuronal et permet alors la translocation de la chaîne légère, qui porte l'activité enzymatique de la molécule de toxine. Cette chaîne légère est une protéase, enzyme qui attaque le complexe SNARE aux jonctions neuromusculaires, empêchant des vésicules de fusionner à la membrane pour libérer l’acétylcholine Subramanyam Swaminathan et Subramaniam Eswaramoorthy, « Structural analysis of the catalytic and binding sites of neurotoxin B », Nature Structural Biology, 2000 (7), 693-9..
La toxine est synthétisée sous forme d’un monomère d'un poids moléculaire de , elle est inactive sous cette forme. Ce monomère est composé de trois domaines : un domaine avec une activité protéase (endopeptidase à zinc), un domaine de translocation et un domaine de liaison. Le domaine de translocation est responsable de la translocation de la chaîne légère qui possède l’activité protéase dans le cytoplasme de la synapse du neurone cible. Le domaine de liaison est composé de deux sous-domaines de taille équivalente. Le sous-domaine HC-N a une structure similaire aux protéines qui lient les sucres. Le sous-domaine HC-C est replié de façon similaire aux protéines connues pour être impliquées dans des fonctions de liaison protéine/protéine. Ce motif contient plus précisément une structure en β-trefoil qui est présente dans plusieurs protéines impliquées dans la reconnaissance et la liaison de protéines comme IL-1, des facteurs de croissance ou d’inhibiteur de trypsine… Une telle structure va permettre la liaison avec la membrane pré-synaptique par l’intermédiaire d’une double interaction entre deux molécules différentes Giampietro Schiavo, Michela Matteoli et Cesare Montecucco, « Neurotoxins affecting neuroexocytosis », Physiological Reviews, 2000 (80), 718-66..
La chaîne inactive de de la neurotoxine est activée par une protéolyse spécifique de la boucle exposée qui contient le pont disulfure reliant la chaîne légère et la chaîne lourde. Plusieurs protéinases endogènes (de la bactérie) ou exogènes (des tissus) peuvent aussi bien activer cette toxine. La chaîne lourde et la chaîne légère restent associées par des liaisons non covalentes de type protéine/protéine et par le pont disulfure au niveau de la boucle de clivage. Pour que le site actif situé sur la chaîne légère soit opérationnel, il faudra rompre le pont disulfure. Cela est réalisé au moment de la translocation.
La suite de l'article s'intéresse plus particulièrement à la toxine botulique B (BoNT/B).
Liaison de la toxine botulique sur la synapse neuronale
Des études ont démontré la fixation de la BoNT/B sur la synaptotagmine. Notamment des études de cristallographie montrant la liaison de la BoNT/B sur la partie extracellulaire de la synaptotagmine par l’intermédiaire d’un ganglioside. C’est la chaine lourde qui possède le domaine de liaison à la synaptotagmine Qing Chai, Joseph W. Arndt, Min Dong, William H. Tepp, Eric A. Johnson, Edwin R. Chapman et Raymond C. Stevens, « Structural basis of cell surface receptor recognition by botulinum neurotoxin B », Nature, 2006 (444), 1096-100. Rongsheng Jin, Andreas Rummel, Thomas Binz et Axel T. Brunger, « Botulinum neurotoxin B recognizes its protein receptor with high affinity and specificity », Nature, 2006 (444), 1092-5..
Internalisation de la toxine dans la synapse
Des études d’immunofluorescence ont montré que la toxine et la synaptotagmine sont co-internalisées par endocytose lorsque cette première est recyclée par la cellule Min Dong, David A. Richards, Michael C. Goodnough, William H. Tepp, Eric A. Johnson et Edwin R. Chapman, « Synaptotagmins and mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells », The Journal of Cell Biology, 2003 (162), 1293–303..
Translocation de la chaîne légère de la toxine dans le cytosol de la synapse
La BoNT/B va donc se retrouver dans une vésicule de la cellule. Ces vésicules vont former un endosome qui va s’acidifier grâce à des pompes à protons. Cette acidification va provoquer un changement de conformation du domaine de translocation (N-Terminal) de la chaîne lourde de la toxine, ce qui facilite la libération de la chaîne légère dans le cytoplasme. Plus précisément, la baisse du pH permet aux chaînes lourdes de former un tétramère qui s’insère dans la membrane de la vésicule pour former des pores. Ce sont sept hélices du domaine de translocation qui permettent la formation de ces pores qui permettront à la chaîne légère de traverser la bicouche lipidique. En effet, l’acidification de la vésicule provoque également la dénaturation de la chaîne légère qui passe d'une forme hydrophile globulaire à une forme globulaire fondue dont les segments hydrophobes sont exposés en surface ce qui permet son insertion. La chaîne légère se détache de la chaîne lourde par réduction du pont disulfure. Ce fondue globulaire a un diamètre inférieur au diamètre du pore formé par la chaîne lourde (). Après exposition au pH neutre du cytosol, la chaîne légère se renature dans le cytosol et retrouve son activité endopeptidase. Ces observations sur la translocation de la BoNT/A peuvent être appliquées aux autres sérotypes de la toxine botulique David H. Hoch, Miryam Romero-Mira, Barbara E. Ehrlich, Alan Finkelstein, Bibhuti R. Dasgupta et Lance L. Simpson, « Channels formed by botulinum, tetanus, and diphtheria toxins in planar lipid bilayers: Relevance to translocation of proteins across membranes », Proc. Nati. Acad. Sci, 1985 (82), 1692-6. Lilia K. Koriazova et Mauricio Montal, « Translocation of botulinum neurotoxin light chain protease through the heavy chain channel », Nature structural biology, 2003 (10), 13-8. Paula F. Flicker, John P. Robinson et Bibhuti R. DasGupta, « Is formation of visible channels in a phospholipid bilayer by botulinum neurotoxin type B sensitive to its disulfide? », Journal of Structural Biology, 1999 (128), 297–304. Shuowei Cai, Roshan Kukreja, Sue Shoesmith, Tzuu-Wang Chang et Bal Ram Singh, « Botulinum neurotoxin light chain refolds at endosomal pH for its translocation », The Protein Journal 2006 (25), 455-62..
Action de la toxine botulique sur le complexe SNARE
class=skin-invert-image|vignette|Protéines cibles des toxines botulique (BoNT) et de la toxine tétanique au niveau du complexe SNARE.
La toxine botulique, une fois entrée dans le cytoplasme de la synapse, va se fixer à sa cible : le complexe SNARE. Les différentes toxines (A à H) agissent sur des protéines différentes ou sur des parties différentes des protéines du complexe SNARE.
Activité endopeptidase à zinc de la toxine botulique
La toxine botulique est une endopeptidase à zinc. Une comparaison de séquence a montré une séquence hautement conservée de 20 acides aminés localisés dans le milieu de la chaîne légère. Cette séquence contient le motif d’une endopeptidase à zinc : His–Glu–Xaa–Xaa–His. Ce motif lie un atome de zinc. Des mesures physicochimiques ont montré que ces molécules de neurotoxine contiennent un seul atome de zinc (sauf le BoNT/C qui en contient deux) qui lie la chaîne légère. Des modifications chimiques et des expériences de mutagénèse dirigée avec ces neurotoxines ont montré que deux résidus d’histidine et un résidu de glutamate sont des ligands de l’atome de zinc. Ce zinc est coordonné par l’, l’ et le chez BoNT/B. Un quatrième ligand : une molécule d’eau permet l’hydrolyse de la liaison peptidique du substrat. Des molécules de calcium ont également un rôle dans l’activité de ces toxines.