vignette|Un chromatographe en phase liquide à haute performance. De gauche à droite : un dispositif de pompage destiné à générer un gradient de deux solvants une colonne de chromatographie et un détecteur pour mesurer l'absorbance. vignette|Un chromatographe en phase liquide à haute performance moderne.
La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) est une technique de séparation analytique et/ou préparatrice de molécules présentes dans un mélange. Cela permet d'adapter les méthodes chromatographiques usuelles (voir Colonne) sur un montage haute pression.
Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie, ainsi qu'en chimie analytique.
Le P du sigle, à l'origine signifiait Pression mais lorsque la méthode a été améliorée (réduction des particules et régulation de la phase stationnaire) le P a été attribué à Performance afin de marquer cette innovation.
Principe L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire (les « grains » sont de très petite taille). Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire.
En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente si la granulométrie est fine. Les pics obtenus (via un détecteur à UVRésultat de l'échantillonnage des cannabinoïdes d'une huile de CBD avec la Chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la détection UV - Naturicious. (les protéines absorbent à 275-) relié à un système d'intégration et de calcul) sont plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien séparés, on peut donc bien les différencier), le seuil de détection est également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas). Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit « gradient » ou « élution graduée » (en opposition au mode « isocratique », pour lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de la séparation).
Par exemple, sur une colonne apolaire, en utilisant un mélange eau/méthanol comme phase mobile, les composants les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol alors que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec une concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase stationnaire et la nature des composés à séparer, on commencera par une concentration élevée en méthanol ou le contraire.
Appareillage et fonctionnement
Pompe C'est la partie qui sert à stocker l'éluant et à l'injecter sous pression dans la colonne. Elle est composée de : deux pistons alternatifs ; réservoirs de phase mobile ; électrovannes ; amortisseur de pulsations ; système de purge et d'amorçage ; capteur de pression. On utilise une pompe pour une élution isocratique ou plusieurs pour une élution par gradient.
Injecteur Des tubes en acier inoxydable, en Téflon, en PEEK ou en silice fondue permettent de relier la ou les pompes à l'injecteur chromatographique. Il y a plusieurs types d'injecteurs : boucle d'injection : permet la répétabilité du volume d'injection ; injecteur seringue ; extraction sur phase solide en ligne.
Détecteur
Il existe plusieurs types de détecteurs : détecteurs spectroscopiques : par spectroscopie d'absorption : ultraviolet-visible (comprenant un détecteur à barrette de diodes (DAD ou PDA)) ou infrarouge, par spectroscopie de fluorescence ; réfractométrie ; détecteurs électrochimiques (DEC) : ampérométriques, coulométriques, polarographiques, potentiométriques ; conductimétrie ; évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL) (evaporative light scattering detector (ELSD) en anglais) ; détection spectrale avec couplage : à la spectrométrie de masse (MS) avec la chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse, à la spectroscopie atomique.
Dégazeur Comme son nom l'indique, ce composant permet de retirer le gaz (dioxygène) présent dans le(s) solvant(s) afin d'éviter d'endommager les échantillons ou la phase stationnaire. Deux types de dégazeurs sont utilisés en HPLC : dégazeur à gaz inerte : on fait barboter un gaz inerte dans la PM (Phase Mobile) pour retirer le gaz dissous dans le liquide. L'helium est le gaz inerte le plus utilisé pour cette application ; dégazeur par vide : cette méthode consiste à descendre en pression dans une enceinte où se trouve le solvant à l'aide d'une pompe à vide primaire, et ainsi séparer le gaz dissous dans le fluide. Elle est bien plus efficace, ne requiert plus de gaz inerte, et remplace de plus en plus l'ancienne technique dans le domaine de l'analyse HPLC. La pression dans l'enceinte est de l'ordre du millibar.
Types Il y a plusieurs types de chromatographie en phase liquide. La nature de la phase stationnaire dépend du type de chromatographie en phase liquide que l'on veut faire ainsi que de la nature et du nombre de composés que l'on veut séparer.
Chromatographie d'adsorption
Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption, telle que l'oxyde d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants.
Chromatographie de partage
Dans cette chromatographie les analytes sont séparés en fonction de leur affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de la polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux types de chromatographie de partage : liquide - liquide : la phase stationnaire consiste en une très fine couche de liquide répartie par adsorption physique à la surface du matériau support le plus inerte possible. Les composants sont séparés comme dans une extraction liquide-liquide, sauf que la répartition des composants se fait lors du passage dans la phase liquide et non par agitation ; liquide - solide ou liquide - phase greffée : la phase stationnaire consiste en une espèce organique liée par des liaisons chimiques à la surface des particules du matériau support.
Chromatographie en phase normale La chromatographie en phase normale (NPLC) consiste à séparer différents analytes selon leur polarité. Cette technique de séparation découle de l’expérience de Tswett et de son montage de chromatographie réalisé avec des pigments végétaux. Au cours des années, cette dernière a été développée davantage afin de séparer des mélanges de plus en plus complexes, en modifiant la polarité des phases et en améliorant la méthodologie de séparation analytique (ajout d’une pompe pour augmenter la pression du système et accélérer l’élution, automatisation du procédé). Celle-ci est basée sur les interactions hydrophiles et les affinités d’un analyte envers la phase mobile et stationnaire dans le but de les séparer en fonction de leur polarité..
Principe
La chromatographie en phase normale (NPLC) est un type de chromatographie qui fait intervenir les interactions polaires, contrairement à la chromatographie en phase inverse (RPLC), qui fait intervenir les interactions hydrophobes. Il s’agit d’un mécanisme de compétition entre la rétention d’un soluté dans la phase stationnaire et l’élution du soluté dans la phase mobile, donc des affinités de chaque analyte envers la phase mobile et la phase stationnaire. On fait donc passer un solvant non polaire ou modérément polaire dans la colonne. Les solutés les plus retenus dans la phase stationnaire seront élués en dernier alors que les solutés les moins retenus seront élués en premier. Différents types d’interactions sont exploités tels que les ponts hydrogène, les interactions dipôle-dipôle et les interactions acide-base.
Phases stationnaires
Les phases stationnaires utilisées pour une chromatographie en phase normale sont des phases polaires. Un avantage de cette chromatographie est qu’il est possible de modifier les interactions, autant celles entre les analytes et la phase stationnaires, que celles avec les analytes et la phase mobile et la phase mobile avec la phase stationnaire. Puisque l’analyte se déplace en fonction de son affinité pour la phase mobile et la phase stationnaire, il est possible de choisir les deux phases afin d’optimiser la séparation d’un système complexe. On peut directement utiliser la silice puisqu’elle contient des groupements silanols (Si-OH) en surface. Selon la méthode utilisée pour la synthèse de la silice, la surface spécifique des particules, le diamètre des particules ainsi que le diamètre des pores varie grandement. Chaque type de silice possède ses propres propriétés de séparation. Des types des silices contenant plus de groupement silanols libres (plus acide) ou moins de groupements silanols peuvent aussi être utilisés en fonction du type de séparation désiré. Il est aussi possible de fonctionnaliser la silice afin de faire varier la polarité ou le caractère de la silice en surface, tout en rendant sa surface plus homogène. Selon le type de séparation que l’on désire faire, on doit choisir entre trois classes de silice fonctionnalisée suivant le triangle de sélectivité suivant : Accepteur de proton ; Donneur de proton ; Interactions dipôle-dipôle.
Si la séparation ne fonctionne pas avec un type de silice, on choisit un second type qui se situe dans une autre classe afin d’engendrer le changement le plus drastique des interactions entre la phase stationnaire et les analytes. Les silices fonctionnalisées les plus souvent utilisées pour la chromatographie en phase normale sont la silice cyanopropylée, la silice aminopropylée et la silice 1,2-hydroxypropylée (diol). D’autres groupements peuvent aussi être utilisés pour la fonctionnalisation de la silice pour des applications plus spécifiques, mais ceux-ci suffisent en général. La colonne diol est une colonne acide, la colonne amino est une colonne plutôt basique alors que la colonne cyano fait des interactions dipôle dipôle modérées.
Phase mobile
Les solvants utilisés sont les mêmes que ceux utilisés pour les autres types de chromatographie. Idéalement, on utilise des solvants peu visqueux, afin de permettre un débit d’éluant plus élevé dans la colonne, dont le point d’ébullition est bas pour faciliter la récupération des analytes après élution. De plus, pour faire la chromatographie, le solvant doit absolument être moins polaire que les analytes pour éviter une élution directe des analytes. En général, on utilise l’hexane ou le pentane comme solvant non polaire de base (que l’on appelle le solvant A). Il est possible de jouer sur la polarité de l’éluant en faisant varier la polarité du solvant A. Il est par contre plus simple d’utiliser un éluant binaire puisque la polarité variera en fonction de la quantité d’un solvant polaire ajouté. Les solvants polaire, aussi appelé solvants modificateurs (solvant B), communément utilisés sont le chloroforme, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le méthyl tert-butyl éther (MTBE), l’éther diéthylique ainsi que des alcools comme le méthanol ou l’isopropanol.
Un autre facteur important concernant la phase mobile est la force du solvant. Puisque la technique est basée sur les différentes interactions entre les analytes, la phase mobile et la phase stationnaire, il est donc important d’ajuster la force de l’éluant, que l’on définit par l’affinité de la phase mobile pour la phase stationnaire. Ainsi, un solvant dont la force d’élution est supérieure à une autre aura plus