miniatura|350px|Diagrama dunha clonación molecular usando bacterias e plásmidos.
A clonación molecular ou clonación de xenes é un conxunto de métodos experimentais de bioloxía molecular que se usan para ensamblar moléculas de ADN recombinante e para dirixir a súa replicación dentro dun organismo hóspede. Utilízase o termo clonación para indicar que o método implica a replicación dunha molécula por un método no que se vai producir unha poboación de células que teñen moléculas de ADN idénticas. Outros tipos de clonación son a clonación celular e a clonación de organismos. A clonación molecular usa xeralmente secuencias de ADN procedentes de dous organismos distintos: a especie que é a fonte do ADN que se vai clonar, e a especie que servirá como hóspede vivo para a replicación do ADN recombinante. Os métodos de clonación molecular son básicos en moitas áreas da bioloxía molecular e medicina contemporáneas.
Nun experimento convencional de clonación molecular, o ADN que se vai clonar obtense dun organismo de interese, despois trátase con encimas no tubo de ensaio para xerar fragmentos de ADN máis pequenos. Despois, estes fragmentos combínanse cun vector de ADN para xerar moléculas de ADN recombinantes. O ADN recombinante introdúcese seguidamente nun organismo hóspede (normalmente unha cepa de laboratorio de Escherichia coli fácil de cultivar e benigna). Isto xerará unha poboación de organismos na cal as moléculas de ADN recombinante se replican ao mesmo tempo que se replica o ADN do hóspede. Como estes organismos conteñen fragmentos de ADN alleos son microorganismos transxénicos ou modificados xeneticamente (OMX). Este proceso aproveita o feito de que unha soa célula bacteriana pode ser inducida a captar e replicar unha soa molécula de ADN recombinante. Esta única célula pode despois ser expandida exponencialmente para xerar unha gran cantidade de bacterias, cada unha das cales contén copias da molécula recombinante orixinal. Así, tanto a poboación bacteriana resultante, coma a molécula de ADN recombinante, denomínanse comunmente "clons". Falando estritamente, o ADN recombinante refírese a moléculas de ADN, mentres que clonación molecular refírese aos métodos usados para ensamblalas e introducilas nas células.
Historia da clonación molecular Antes da década de 1970, a comprensión da xenética e bioloxía molecular estaba gravemente dificultada pola incapacidade de illar e estudar xenes individuais de organismos complexos. Isto cambiou totalmente cando apareceron os métodos de clonación molecular. Os microbiólogos que trataban de comprender os mecanismos moleculares por medio dos cales as bacterias restrinxían a replicación no seu interior de bacteriófagos, illaron endonucleases de restrición, encimas que podían cortar (clivar) moléculas de ADN cando encontraban nelas certas secuencias de nucleótidos específicas. Descubriron que os encimas de restrición clivaban moléculas de ADN de lonxitude cromosómica en sitios específicos, e que as seccións específicas dunha molécula longa podían purificarse por fraccionamento por tamaños. Usando un segundo encima chamado ADN ligase, podían unir os fragmentos xerados polos encimas de restrición formando novas combinacións, orixinando o que se denominou ADN recombinante. Ao recombinaren segmentos de ADN de interese cun vector de ADN, como un bacteriófago ou un plásmido, os cales se replican de forma natural dentro da bacteria, os científicos podían producir grandes cantidades de ADN recombinante purificado en cultivos bacterianos. As primeiras moléculas de ADN recombinantes xeráronse e estudáronse en 1972.
Introdución A clonación molecular aprovéitase de que a estrutura química do ADN é fundamentalmente a mesma en todos os organismos vivos. Por tanto, se calquera segmento de ADN de calquera organismo se insire nun segmento de ADN que contén as secuencias moleculares que son necesarias para a replicación do ADN, e o ADN recombinante resultante se introduce no organismo no cal se obtiveran ditas secuencias, o ADN alleo replicarase á vez que o ADN da célula hóspede no organismo transxénico.
A clonación molecular é similar á reacción en cadea da polimerase (PCR) en que permite a replicación da secuencia de ADN. A diferenza fundamental entre estes dous métodos é que a clonación molecular implica a replicación do ADN nun organismo vivo, mentres que a PCR replica o ADN nunha solución in vitro, sen células vivas.
Pasos a seguir nunha clonación molecular En experimentos de clonación convencionais, a clonación de calquera fragmento de ADN implica esencialmente seguir sete pasos: (1) elixir un organismo hóspede e o vector de clonación, (2) preparación do vector de ADN, (3) preparación do ADN que se vai clonar, (4) creación do ADN recombinante, (5) introdución do ADN recombinante no organismo hóspede, (6) selección de organismos que conteñen ADN recombinante, (7) detección e selección dos clons coa inserción do ADN desexado e propiedades biolóxicas procuradas.
Aínda que se pode facer a planificación dunha clonación en calquera editor de texto, e usar ferramentas en liña para, por exemplo, o deseño de cebadores de PCR, existe tamén software específico para ese mester. Ese software inclúe por exemplo ApE (de código aberto), DNAStrider (de código aberto), Serial Cloner (gratuíto) e Collagene (de código aberto).
Elección do organismo hóspede e o vector de clonación Aínda que se usan unha gran variedade de organismos hóspedes e vectores de clonación molecular, a gran maioría dos experimentos de clonación molecular empezan usando unha cepa de laboratorio da bacteria Escherichia coli e un vector de clonación plásmido. Escherichia coli e os vectores plásmidos teñen un uso tan común porque son tecnicamente sofisticados, versátiles, están doadamente dispoñibles, e facilitan un crecemento rápido dos organismos recombinantes requirindo un mínimo equipamento. Se o ADN que hai que clonar é excepcionalmente grande (de miles a millóns de pares de bases), entón a miúdo o que se elixe é usar un cromosoma artificial bacteriano ou un cromosoma artificial de lévedo.
Certas aplicacións especializadas poden necesitar sistemas hóspede-vector especializadas. Por exemplo, se os experimentadores queren recoller unha determinada proteína a partir do organismo recombinante, entón elíxese un vector de expresión que contén sinais apropiados para a transcrición e a tradución no organismo hóspede desexado. Alternativamente, se o que se pretende é a replicación do ADN en diferentes especies (por exemplo, a transferencia de ADN desde bacterias a plantas), pode seleccionarse un vector cun rango de múltiples hóspedes (tamén chamado vector lanzadeira). Porén, na práctica, os experimentos de clonación molecular especializados xeralmente empezan cunha clonación nun plásmido bacteriano, seguida da subclonación no vector especializado.
Sexa cal for a combinación do hóspede e o vector utilizada, o vector case sempre contén catro segmentos de ADN que teñen unha importancia esencial para a súa función e utilidade experimental, que son os seguintes: (1) unha orixe de replicación do ADN, que cómpre para que se replique o vector (e as secuencias recombinantes ligadas a el) dentro do organismo hóspede, (2) un ou máis sitios de recoñecemento de endonuclease de restrición únicos que funcionan como sitios nos que se pode introducir o ADN alleo, (3) un xene que sirva de marcador xenético seleccionable que pode utilizarse para permitir a supervivencia das células que captaron as secuencias vectoras, e (4) un xene adicional que pode usarse para detectar cales células conteñen o ADN alleo.
Preparación do ADN vector O vector de clonación trátase cunha endonuclease de restrición para clivar o ADN no sitio no que se inserirá o ADN alleo. O encima de restrición elíxese para que xere unha configuración no sitio de clivaxe que é compatible coa que hai nos extremos do ADN alleo. Tipicamente, isto faise clivando o ADN vector e o ADN alleo co mesmo encima de restrición, por exemplo EcoRI. A maioría dos vectores modernos conteñen unha variedade de sitios de clivaxe convenientes que son únicos dentro da molécula vector (de modo que o vector só pode ser clivado nun só sitio) e están localizados dentro dun xene (frecuentemente o da beta-galactosidase) cuxa inactivación pode utilizarse para distinguir os organismos recombinantes dos non recombinantes nun paso final do proceso. Para mellorar a proporción de organismos recombinantes e non recombinantes, o vector clivado pode ser tratado cun encima (fosfatase alcalina) que desfosforila os extremos do vector. As moléculas vector con extremos desfosforilados non poden replicarse, e a capacidade de replicación só pode recuperarse se o ADN alleo se integra no sitio de clivaxe.
Preparación do ADN que se vai clonar Para clonar ADN xenómico, extráese o ADN que se quere clonar do organismo de interese. Pode usarse virtualmente calquera fonte de tecido (mesmo tecidos de animais extintos ), con tal de que o ADN non estea moi degradado. O ADN é despois purificado usando métodos simples para eliminar as proteínas contaminantes (extracción con fenol), ARN (ribonuclease) e moléculas máis pequenas (precipitación e/ou cromatografía). Tamén se usan a miúdo métodos con reacción en cadea da polimerase (PCR) para a amplificación de secuencias de ADN ou ARN específico (RT-PCR) antes da clonación molecular.
O ADN para os experimentos de clonación pode obterse tamén a partir dun ARN usando o encima transcriptase inversa (é ADN complementario ou clonación de ADNc), ou en forma de ADN sintético (síntese de xenes artificial). A clonación do ADNc utilízase xeralmente para obter clons representativos da poboación de ARNm das células de interese, mentres que se usa o ADN sintético para obter calquera secuencia precisa definida polo deseñador.
O ADN purificado é despois tratado cun encima de restrición para xerar fragmentos con extremos que poden ser ligados aos do vector. Se é necesario, poden engadirse segmentos de ADN curtos de dobre cadea (linkers) que conteñen os sitios de restrición desexados para crear estruturas nos extremos que sexan compatibles co vector.
Creación do ADN recombinante cunha ADN ligase A creación doADN recombinante é en moitos aspectos o paso máis simple do proceso de clonación molecular. O ADN preparado a partir do vector e a fonte allea de ADN simplemente se mesturan ás concentracións axeitadas e son expostas a un encima (ADN ligase) que liga covalentemente os extremos. Esta reacción de unión denomínase xeralmente ligación. A mestura de ADN resultante que contén extremos unidos aleatoriamente está lista para a súa introdución no organismo hóspede.
A ADN ligase só recoñece e actúa sobre os extremos de moléculas de ADN lineares, o que normalmente ten como resultado unha complexa mestura de moléculas de ADN con extremos unidos aleatoriamente. Estarán presentes os produtos desexados (ADN vector ligado covalentemente a un ADN alleo), pero tamén aparecerán outras secuencias que non interesan (por exemplo, ADN ligado consigo mesmo, ADN vector ligado consigo mesmo e combinacións de orde superior dos ADN alleo e vector). Nesta mestura complexa faise unha selección nos pasos seguintes do proceso de clonación, despois de que a mestura do ADN se introduce nas células.
Introdución do ADN recombinante no organismo hóspede A mestura de ADN, previamente manipulada in vitro, será agora introducida de novo nunha célula viva, chamada organismo hóspede. Os métodos usados para introducir o ADN nas células son variados, e o nome que se aplica a este paso depende do método experimental elixido; por exemplo, transformación, transdución, transfección, electroporación.