A antitrombina (AT) é unha pequena proteína que inactiva varios encimas do sistema de coagulación do sangue. A antitrombina humana é unha glicoproteína producida polo fígado e consta de 432 aminoácidos. Contén tres pontes disulfuro e un total de catro sitios de glicosilación posibles. A α-antitrombina é a forma dominante da antitrombina que se encontra no plasma sanguíneo e ten un oligosacárido que ocupa cada un dos seus catro sitios de glicosilación. Nunha forma menor da antitrombina, chamada β-antitrombina, un só dos sitios de glicosilación permanece sempre desocupado . A súa actividade multiplícase en presenza do fármaco anticoagulante heparina, que potencia a unión da antitrombina ao factor IIa (trombina) e ao factor Xa.
Nomenclatura
A antitrombina tamén se chama antitrombina III (AT III). As designacións de antitrombina I ata antitrombina IV orixináronse nos estudos iniciais sobre esta proteína levados a cabo na década de 1950 por Seegers, Johnson e Fell.
A antitrombina I (AT I) refírese á absorción da trombina sobre a fibrina despois de que a trombina activou o fibrinóxeno. A antitrombina II (AT II) refírese a un cofactor que se encontra no plasma, que xunto coa heparina interfire coa interacción entre a trombina e o fibrinóxeno. A antitrombina III (AT III) refírese á substancia do plasma que inactiva a trombina. A antitrombina IV (AT IV) refírese a unha antitrombina que queda activada durante ou pouco despois da coagulación do sangue. Só son medicamente significativas a AT III e posiblemente a AT I. A AT III (antitrombina III) denomínase xeralmente simplemente "antitrombina" e é a proteína que se discute neste artigo.
Xene A antitrombina humana está codificada no xene SERPINC1 do cromosoma 1 (1q25.1). É un xene con 7 exóns e con varios segmentos de secuencias Alu repetitivas que ocupan un 22% da secuencia intrónica.OMIM Serpin peptidase inhibitor, clade C (antithrombin), member 1; SERPINC1
Estrutura
miniatura|Figura 1. Móstrase a localización dos catro sitios potenciais de glicosilación na estrutura terciaria dun monómero de antitrombina, tal como figura no arquivo de Protein Data Bank 2ANT. Nesta estrutura só a Asn 155 está glicosilada pola adición dun só residuo de N-acetilglicosamina.|esquerda|500px A proteína antitrombina ten unha vida media no plasma sanguíneo duns 3 días. A concentración normal de antitrombina no plasma sanguíneo humano é alta e de aproximadamente 0,12 mg/mL, o cal equivale a unha concentración molar de 2,3 μM. A antitrombina foi illada do plasma sanguíneo dun gran número de especies ademais de en humanos. Como se deduce da secuenciación do ADNc e da proteína, as antitrombinas de vacas, ovellas, coellos e ratos teñen todas 433 aminoácidos, o cal é un aminoácido máis que a antitrombina humana. O aminoácido extra está na posición 6. As antitrombinas de vacas, ovellas, coellos, ratos e humanos comparten entre o 84 e o 89% dos aminoácidos. Seis dos aminoácidos forman tres pontes disulfuro intramoleculares, Cys8-Cys128, Cys21-Cys95 e Cys248-Cys430. Todas teñen catro sitios potenciais de N-glicosilación. Estes aparecen nas posicións con asparaxina (Asn) 96, 135, 155 e 192 en humanos e en similares posicións noutras especies. Todos estes sitios están ocupados por cadeas laterais de oligosacáridos unidos covalentemente na forma predominante da antitrombina humana, a α-antitrombina, o que ten como resultado un peso molecular desta forma de antitrombina de 58 200 Da. O sitio de glicosilación potencial na asparaxina 135 non está ocupado nunha forma menor de antitrombina (que supón o 10%), chamada β-antitrombina (ver Figura 1).
As antitrombinas recombinantes con propiedades similares ás da antitrombina normal humana foron producidas usando células de insectos infectadas por baculovirus e liñas de células de mamíferos en cultivo celular. Estas antitrombinas recombinantes xeralmente teñen diferentes padróns de glicosilación qaue os da antitrombina normal e son usados tipicamente en estudos estruturais da antitrombina. Por esta razón, moitas das estruturas de antitrombina almacendas na Protein Data Bank e presentadas neste artigo mostran padróns de glicosilación variables.
A antitrombina empeza no seu estado nativo, que ten unha maior enerxía libre comparada co estado latente, o cal se degrada como media despois de 3 días. O estado latente ten a mesma forma que o estado activado, é dicir, cando está inhibindo a trombina. Xa que logo, é un exemplo clásico da utilidade do control cinético fronte ao termodinámico do pregamento de proteínas.
Función
miniatura|Figura 2. O enlace reactivo Arg393-Ser394 está localizado nun bucle exposto na superficie da molécula. Este bucle denomínase bucle do sitio reactivo (RSL) ou bucle do centro reactivo (RCL). |esquerda|460px miniatura|Figura 3. Móstrase a secuencia de aminoácidos do bucle do sitio reactivo da antitombina humana. O bucle do sitio reactivo comprende a secuencia desde o aminoácido 377 ao 400 (os numeros móstranse na parte de abaixo da figura) ou nos aminoácidos P1 a P17 e P1' a P7' usando a convención de Schechter e Berger (os números móstranse na parte superior da figura). O enlace reactivo indícase por unha frecha.|esquerda|460px A antitrombina é unha serpina (inhibidor da serina protease) e ten, pois, unha estrutura similar á maioría dos demais inhibidores de proteases do plasma sanguíneo, como a alfa 1-antiquimotripsina, alfa 2-antiplasmina e cofactor II da heparina.
As proteases que son as dianas fisiolóxicas da antitrombina son as que forman parte da vía de activación por contacto da coagulación sanguínea (antes chamada vía intrínseca), concretamente as formas activadas dos factores X (Xa), IX (IXa), XI (XIa), XIII (XIIa) e, en gran medida, o II (trombina ou IIa), e tamén a forma activada do factor VII (VIIa) da vía do factor tisular (antes chamada vía extrínseca). O inhibidor tamén inactiva a calicreínaA.M.Venneröd, K.Laakea, A. K. Solberga, S. Strömlanda. Inactivation and binding of human plasma kallikrein by antithrombin III and heparin. Thrombosis Research. Volume 9, Issue 5, November 1976, Pages 457-466. doi.org/10.1016/0049-3848(76)90201-2 e a plasminaM.W.C. Hatton, E. Regoeczi. The inactivation of thrombin and plasmin by antithrombin III in the presence of Sepharose-heparin. Thrombosis research. May 1977. Volume 10, Issue 5, Pages 645–660. /doi.org/10.1016/0049-3848(77)90047-0, tamén implicadas na coagulación do sangue. Porén, inactiva outras serina proteases que non interveñen na coagulación como a tripsina e a subunidade C1s do encima C1 implicado na vía clásica do complemento.
A inactivación das proteases é a consecuencia do atrapamento da protease nun complexo equimolar coa antitrombina, no cal o sitio activo do encima protease é inaccessible ao seu substrato habitual. A formación dun complexo antitrombina-protease implica unha interacción entre a protease e un enlace peptídico reactivo específico da antitrombina. Na antitrombina humana este enlace é entre a arxinina (Arg) 393 e a serina (Ser) 394 (ver Figura 2 e Figura 3).
Pénsase que os encimas proteases quedan atrapados en complexos inactivos antitrombina-protease como consecuencia do seu ataque sobre o enlace reactivo. Aínda que atacar un enlace similar dentro do substrato protease normal ten como resultado unha rápida clivaxe proteolítica do substrato, iniciar un ataque sobre o enlace reactivo da antitrombina causa que a antitrombina se active e atrape o encima nun estado intermediario do proceso proteolítico. Deixando pasar o suficiente tempo, a trombina pode clivar o enlace reactivo da molécula de antitrombina e disóciase un complexo antitrombina-trombina inactivo, aínda que o tempo que tarda en producirse isto pode ser de máis de 3 días. Porén, os enlaces P3-P4 e P1'-P2' poden ser rapidamente clivados polos encimas elastase do neutrófilo e a termolisina bacteriana, respectivamente, o que dá como resultado antitrombinas inactivas que xa non poden inhibir a actividade de trombina.
O grao de inhibición pola antitrombina da actividade de protease é moi aumentada pola súa unión adicional á heparina, igual que a súa inactivación pola elastase do neutrófilo.
Antitrombina e heparina A antitrombina inactiva os seus encimas diana fisiolóxicos: trombina, factor Xa e factor IXa con constantes de velocidade de 7–11 x 103, 2,5 x 103 M−1 s−1 e 1 x 10 M−1 s−1, respectivamente. A velocidade de inactivación da antitrombina-trombina increméntase a 1,5 - 4 x 107 M−1 s−1 en presenza de heparina, é dicir, a velocidade da reacción multiplícase por 2000 a 4000. A inhibición do factor Xa é acelerada só de 500 a 1000 veces en presenza de heparina e a constante de velocidade máxima é 10 veces inferior que a da inhibición da trombina. En presenza de heparina e con niveis fisiolóxicos de calcio a velocidade da inhibición antitrombina-factor IXa multiplícase por aproximadamente un millón.
AT-III únese a unha secuencia pentasacárida sulfatada contida no poilímero de heparina, que é
GlcNAc/NS(6S)-GlcA-GlcNS(3S,6S)-IdoA(2S)-GlcNS(6S)
Despois da unión a esta secuencia pentasacárida, a inhibición da actividade de protease é incrementada pola heparina por medio de dous mecanismos. Nun mecanismo a estimulación por heparina da inhibición dos factores IXa e Xa depende dun cambio conformacional na antitrombina, que implica ao bucle do sitio reactivo e é, pois, alostérica. Noutro mecanismo a estimulación da inhibición da trombina depende da formación dun complexo ternario entre a AT-III, a trombina e a heparina.
Activación alostérica miniatura|Figura 4. Dúas estruturas cristalinas da antitrombina. O modelo A procede do ficheiro de PDB 2ANT e o modelo B do 1AZX. O modelo B está acomplexado cun pentasacárido, mentres que o modelo A non está acomplexado.|esquerda|400px
O incremento da inhibición dos factores IXa e Xa require a secuencia pentasacárida da heparina mínima. Os cambios conformacionais que ocorren na antitrombina en resposta á unión do pentascárido están ben documentados.
En ausencia de heparina, os aminoácidos P14 e P15 (ver Figura 3) do bucle do sitio reactivo están incrustados dentro do corpo principal da proteína (concretamente na parte superior da folla beta A). Esta característica é común á doutras serpinas como o cofactor II da heparina, a alfa 1-antiquimotripsina e a MENT.
O cambio conformacional máis relevantedo da inhibición do factor IXa e Xa implica os aminoácidos P14 e P15 na rexión N-terminal do bucle do sitio reactivo (rodeado por un círculo no modelo B da Figura 4). Esta rexión foi denominada rexión bisagra. O cambio conformacional na rexión bisagra en resposta á unión da heparina ten como resultado a expulsión de P14 e P15 do corpo principal da proteína e impide este cambio conformacional, e o aumento da inhibición dos factores IXa e Xa non ocorre. Pénsase que o incremento da flexibilidade que adquire o bucle do sitio reactivo como resultado do cambio conformacional da rexión bisagra é un factor clave que inflúe no incremento da inhibición dos factores IXa e Xa. Calculouse que en ausencia do pentascárido só unha de cada 400 moléculas de antitrombina (o 0,25%) está na conformación activa cos aminoácidos P14 e P15 expulsados.
Activación non alostérica
Para que se produza o incremento da inhibición da trombina cómpre o pentasacárido da heparina mínimo e ademais polo menos unhas 13 unidades monoméricas adicionais. Pénsase que isto se debe a que a antitrombina e a trombina debe unirse á mesma cadea de heparina e quedar unha ao lado da outra.