200px|miniatura|Imaxe dixital do resultado da electroforese de tres dixestións con encimas de restrición de plásmidos en xel de agarosa ao 1% w/v, a 3 volt/cm, tinguido con bromuro de etidio. O marcador do tamaño do ADN é unha escada comercial de 1 kbp. Indícase a posición dos pozos e a dirección da migración do ADN.
A electroforese en xel de agarosa é un método de electroforese en xel usado en bioquímica, bioloxía molecular, xenética e química clínica para separar unha poboación mixta de macromoléculas como ADN e proteínas nunha matriz de agarosa, un dos dous compoñentes principais do ágar. As biomoléculas sepáranse aplicando un campo eléctrico para mover as moléculas cargadas a través da matriz de agarosa, e as biomoléculas son separadas por tamaños na matriz do xel de agarosa.Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. As proteínas poden separarse pola carga e o tamaño (a electroforese en agarosa de isoelectroenfoque é esencialmente dependente do tamaño), e a lonxitude dos fragmentos de ADN e ARN.
O xel de agarosa é doado de preparar, e ten relativamente poucos grupos cargados e é especialmente axeitado para a separación de ADN dos tamaños que se adoitan encontrar normalmente nos laboratorios, o que explica o estendido que está o seu uso. O ADN separado pode visualizarse con tinguiduras, normalmente baixo a luz ultravioleta, e os fragmentos poden ser extraídos do xel con relativa facilidade. A maioría das veces a agarosa usada está nunha concentración entre o 0,7 e o 2% disolta nun tampón electroforético adecuado.
Propiedades do xel de agarosa
right|miniatura|Un xel de agarosa preparado nunha bandexa para xel de electroforese
O xel de agarosa é unha matriz tridimensional formada por moléculas helicoidais de agarosa en feixes supeenrolados que se agregan en estruturas tridimensionais con canles e poros polos cales poden pasar as biomoléculas. A estrutura tridimensional mantense grazas a enlaces de hidróxeno e pode, por tanto, ser alterada quentándoa ata que volva ao estado líquido. A temperatura de fusión é diferente da temperatura de xelificación, dependendo das fontes, o xel de agarosa ten unha temperatura de xelificación de entre 35 e 42 °C e unha temperatura de fusión de 85 a 95 °C. Tamén se dispón de agarosas de fusión baixa e xelificación baixa que se obteñen por modificacións químicas.
O xel de agarosa ten un gran tamaño de poro e unha boa forza de xel, polo que é axeitado como medio anticonvección para a electroforese do ADN e de moléculas proteicas grandes. O tamaño do poro do xel ao 1% estimouse que está entre 100 nm e 200–500 nm, e a forza do xel permite que os xeles se poidan diluír ata o 0,15% para formar un bloque para electroforese en xel. Porén, os xeles de baixa concentración (0,1–0,2%) son fráxiles e, por tanto, difíciles de manexar. O xel de agarosa ten un poder de resolución inferior que o do xel de poliacrilamida para o ADN pero un maior rango de separación e, por tanto, úsase para fragmentos de ADN xeralmente de 50–20.000 pares de bases de tamaño. O límite de resolución dun xel de agarosa para a electroforese en xel de agarosa estándar é dunhas 750 kb, pero é posible tamén unha resolución duns 6 Mb con electroforese en xel de campo pulsado (PFGE). Pode tamén utilizarse para separar grandes proteínas e é a matriz preferida para a electroforese en xel de partículas con raios efectivos maiores de 5 a 10 nm. Un xel de agarosa ao 0,9% ten poros dabondo grandes como para permitir a entrada do virus bacteriófago T4.
O polímero de agarosa contén grupos cargados de piruvato e sulfato. Estes grupos cargados negativamente crean un fluxo de auga en dirección oposta ao movemento do ADN nun proceso chamado electroendosmose (EEO), e pode, por tanto, retardar o movemento do ADN e causar un esvaecemento das bandas. Os xeles de maior concentración teñen un maior fluxo electroosmótico. A agarosa de baixa EEO é, por tanto, a normalmente preferida para a electroforese en xel de ácidos nucleicos, pero a agarosa de alta EEO pode utilizarse para outros propósitos. O baixo contido en sulfato da agarosa de baixa EEO, especialmente a agarosa de baixo punto de fusión, é tamén beneficioso en casos nos que o ADN extraído do xel vai ser usado para unha posterior manipulación, xa que a presenza de sulfatos contaminantes pode afectar algúns dos procedementos posteriores, como a ligazón e a reacción en cadea da polimerase (PCR). Porén, as agarosas con EEO cero non son desexables para algunhas aplicacións, xa que poden prepararse engadindo grupos cargados positivamente e ditos grupos poden afectar reaccións encimáticas posteriores. A electroendosmose (EEO) é a razón pola cal se usa a agarosa en vez de ágar, xa que o compoñente de agaropectina do ágar contén unha canidade significativa de sulfato cargado negativamente e grupos carboxilo. A retirada da agaropectina da agarosa reduce substancialmente a EEO, así como reduce a adsorción non específica de biomoléculas á matriz do xel. Porén, para algunhas aplicacións como a electroforese de proteínas do soro sanguíneo, pode ser conveniente unha alta EEO, e pode engadirse agaropectina ao xel utilizado.
Factores que afectan a migración de ácidos nucleicos no xel
miniatura|280px|Os xeles de preparacións de plásmidos xeralmente mostran unha banda grande de ADN superenrolado xunto con outras bandas máis débiles no mesmo carreiro. Nótese que por convención o xel de ADN móstrase cos fragmentos de ADN menores máis preto da parte baixa do xel. Isto débese a que historicamente os xeles de ADN corríanse verticalmente e os fragmentos de ADN menores movíanse cara a abaixo máis rápido.
Hai varios factores que poden afectar a migración dos ácidos nucleicos no xel: a dimensión dos poros do xel (concentración do xel), tamaño do ADN que vai ser sometido a electroforese, a voltaxe utilizada, a forza iónica do tampón, e a concentración da tinguidura intercalante como o bromuro de etidio se for usado durante a electroforese.
As moléculas pequenas viaxan máis rápido polo xel que as grandes, e o ADN bicatenario móvese a unha velocidade que é inversamente proporcional ao logaritmo do número de pares de bases. Porén, estas relacións non se cumpren con fragmentos de ADN moi grandes, e a separación de fragmentos de ADN moi grandes require o uso de electroforese en xel de campo pulsado (PFGE), a cal aplica correntes que se alternan en dúas direccións e os fragmentos de ADN grandes son separados a medida que se reorientan coa corrente cambiante.
Para unha electroforese en xel de agarosa estándar, as moléculas grandes resólvense mellor usando un xel a baixa concentración mentres que as moléculas menores sepáranse mellor con xeles de alta concentración. Porén, o xel de alta concentración require períodos de electroforese máis prolongados (ás veces de días).
O movemento do ADN pode vese afectado pola conformación da molécula de ADN, por exemplo, o ADN superenrolado xeralmente móvese máis rápido que o ADN relaxado porque está enrolado apertadamente e é máis compacto. En preparacións de ADN de plásmidos normais poden estar presentes múltiples formas de ADN. A electroforese en xel dos plásmidos normalmente mostra na banda principal a forma con superenrolamento negativo, mentres que o ADN con amosega (forma circular aberta) e a forma circular pechada relaxada aparecen nas bandas menores. Non obstante, a velocidade á que se moven estas diversas formas pode cambiar usando condicións electroforéticas diferentes e a mobilidade do ADN circular máis grande pode verse máis fortemente afectada que a do ADN lineal polo tamaño de poro do xel.
O bromuro de etidio que se intercala no ADN circular pode cambiar a carga, lonxitude e superhelicidade da molécula de ADN, polo que a súa presenza no xel durante a electroforese pode afectar o seu movemento. Por exemplo, a carga positiva do bromuro de etidio pode reducir o movemento do ADN nun 15%. A electroforese en xel de agarosa pode utilizarse para resolver o ADN circular con diferentes topoloxías de superenrolamento.
Os danos no ADN debidos ao aumento do establecemento de enlaces cruzados tamén reduce a migración electroforética do ADN de maneira dependente da dose.
A velocidade de migración do ADN é proporcional á voltaxe aplicada, é dicir, canta maior voltaxe, máis rápido se move o ADN. Porén, a resolución de grandes fragmentos de ADN é peor a voltaxes altas. A mobilidade do ADN pode tamén cambiar nun campo inestable, xa que nun campo que é invertido periodicamente a mobilidade do ADN dun determinado tamaño pode diminuír significativamente a unha determinada frecuencia de ciclos. Este fenómeno pode ter como resultado a inversión de bandas na electroforese en xel de inversión de campo (FIGE), na que os fragmentos grandes de ADN se moven máis rápido que os pequenos.
Anomalías na migración
Xeles "Smiley".- Este efecto de bordo é causado cando a voltaxe aplicada é demasiado alta para a concentración do xel usada. Sobrecarga de ADN.- Esta sobrecarga fai máis lenta a migración dos fragmentos de ADN. Contaminación.- A presenza de impurezas, como sales ou proteínas pode afectar o movemento do ADN.
Mecanismo de migración e separación
A carga negativa do seu esqueleto de fosfato fai que o ADN se mova cara ao ánodo cargado positivamente durante a electroforese. Porén, a migración de moléculas de ADN na solución, e ausencia dunha matriz de xel, é independente do peso molecular durante a electroforese. A matriz do xel é, por tanto, responsable da separación do ADN por tamaño durante a electroforese, e existen varios modelos para explicar o mecanismo de separación de biomoléculas na matriz do xel. Un modelo amplamente aceptado é o modelo Ogston, que trata a matriz do polímero como un baruto. Unha proteína globular ou un ADN con enrolamento ao azar móvese a través de poros interconectados, e o movemento das moléculas máis grandes é máis probable que sexa empecido e ralentizado polas colisións coa matriz do xel e as moléculas de diferentes tamaños poden separarse neste proceso de peneirado.
Porén, o modelo Ogston falla para as moléculas grandes cando os poros son significativamente menores que a molécula. Para as moléculas de ADN de tamaño maior de 1 kb, utilízase xeralmente un modelo de reptación (ou as súas variantes). Este modelo asume que o ADN pode reptar "ao xeito das cobras" a través dos poros como unha molécula alongada. A forzas de campo eléctrico maiores aplícase un modelo de reptación nesgado, no que o extremo en posición dianteira da molécula está fortemente nesgado a ir na dirección cara a adiante e tira do resto da molécula. Porén, a microscopia de fluorescencia en tempo real de moléculas tinguidas mostrou unha dinámica máis sutil durante a electroforese, na que o ADN mostraba unha considerable elasticidade a medida que se estiraba na dirección do campo aplicado e despois se contraía formando unha bóla, ou quedaba enganchado en forma de U cando era agarrado polas fibras do polímero.
Procedemento xeral
Os detalles dun experimento de electroforese en xel de agarosa poden variar dependendo do método, pero a maioría segue un procedemento xeral. miniatura|none|Vídeo que mostra o funcionamento da electroforese.
Preparación do xel miniatura|180px|Carga de mostras de ADN nos pozos dun xel de agarosa usando unha pipeta multicanle.
O xel prepárase disolvendo pos de agarosa nun tampón apropiado, como o TAE ou o TBE, para usalo na electroforese. A agarosa é dispersada no tampón antes de quentalo ata case o punto de ebulición, pero evitando chegar a el. A agarosa fundida déixase arrefriar o suficiente antes de verter a solución nun molde, xa que este podería torcerse ou rachar se a solución de agarosa está demasiado quente. Sitúase un peite no molde para crear os pozos para a carga da mostra e o xel debería estar completamente formado antes do seu uso.