ADN antigo

miniatura|ADN extraído dun fígado de 4000 anos de antigüidade dun antigo sacerdote exipcio.

O ADN antigo (ADNa ou aDNA) é o ADN que se illa de espécimes biolóxicos antigos. Debido aos procesos de degradación que sofre o ADN (como a formación de enlaces cruzados, desaminación e fragmentación) o ADN antigo é de baixa calidade comparado con material xenético fresco moderno.Allentoft, M.E. et al., 2012. The half-life of DNA in bone: measuring decay kinetics in 158 dated fossils. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 279, pp.4724–4733. Mesmo nas mellores condicións para a preservación, hai un límite de antigüidade de 0,4-1,5 millóns de anos para as mostras, por debaixo do cal conteñen ADN suficiente como para aplicarlle as tecnoloxías de secuenciación contemporáneas.Willerslev, E. et al., 2004. Long-term persistence of bacterial DNA. Current biology: CB, 14(1), pp.9–10. Recuperouse material xenético de material esquelético e arqueolóxico histórico, tecidos de momias, coleccións de arquivos de espécimes médicos non conxelados, restos de plantas conservados, núcleos de xeo e do permafrost e de sedimentos mariños e lacustres.

Historia dos estudos sobre ADN antigo

Década de 1980

O primeiro estudo do que se chamaría ADNa realizouse en 1984 cando Russ Higuchi e colegas na Universidade de California, Berkeley informaron de que detectaran trazas de ADN nun espécime de museo de cebra quagga que non só estaban conservados 150 anos despois da morte do espécime, senón que puideron ser extraídos e secuenciados. Nos seguintes dous anos, facendo investigacións en espécimes momificados por causas naturais ou artificiais, Svante Pääbo confirmou que este fenómeno non estaba limitado a espécimes de museo relativamente recentes, senón que podía ser replicado en diversas mostras humanas momificadas de varios miles de anos de antigüidade.Pääbo 1985a; Pääbo 1985b; Pääbo 1986

O laborioso proceso que había que seguir naquela época para secuenciar estes ADN (por medio de clonación bacteriana) era un freo efectivo para o desenvolvemento do campo do ADN antigo. Porén, coa aparición da técnica da reacción en cadea da polimerase (PCR) a finais da década de 1980, esta área empezou a progresar rapidamente. A amplificación por PCR de dobre cebador dun ADNa (jumping-PCR) pode producir artefactos de secuencia nesgados e non auténticos. Recorreuse a unha estratexia de PCR aniñada de múltiples cebadores para superar aquelas limitacións.

Década de 1990

Na era post-PCR houbo unha vaga de publicacións a medida que numerosos grupos de investigadores se dedicaron a estudar o ADNa. Axiña, publicáronse unha serie de incribles descubrimentos, que afirmaban ter extraído auténtico ADNa de espécimes de millóns de anos de antigüidade, ao que Lindahl (1993b) denominou ADN antediluviano.Lindahl 1993b A maioría desas afirmacións estaban baseadas na recuperación de ADN de organismos preservados en ámbar. Extraéronse secuencias de insectos como as abellas sen ferrete,Cano et al. 1992a; Cano et al. 1992b térmites,De Salle et al. 1992; De Salle et al. 1993 e dípteros,De Salle and Grimaldi 1994 plantasPoinar et al. 1993 e bacteriasCano et al. 1994 preservados en ámbar dominicano que databan do Oligoceno. De fontes aínda máis antigas de gurgullos incluídos en ámbar libanés que databan do Cretáceo, obtívose tamén ADN auténtico.Cano et al. 1993 Pero a recuperación de ADN non estaba limitada ao ámbar.

Varios restos de plantas conservadas nos sedimentos que datan do Mioceno foron tamén investigados con éxito.Golenberg et al. 1990; Golenberg 1991 Despois, en 1994 e Woodward et al. informaron dos resultados máis excitantes ata ese momento: as secuencias de citocoromo b mitocondrial que aparentemente foran extraídas de ósos de dinosauro de 80 millóns de anos de antigüidade. Cando en 1995 outros dous estudos informaron de secuencias de ADN extraídas de ovos de dinosauros do Cretáceo,An et al. 1995; Li et al. 1995 parecía que esta rama da ciencia ía revolucionar o coñecemento da evolución na Terra no pasado. Isto culminou coa recuperación de secuencias de halobacterias de hai 250 millóns de anos conservadas en halita.

A secuenciación de xenoma completo empezou a producir resultados en 1995.

Década do 2000

A amplificación por extensión de cebador único (abreviada SPEX) presentouse en 2007 para estudar danos por modificación do ADN post mortem.

A revolución do ADN antigo Desde 2009 o campo dos estudos sobre o ADNa sufriu unha revolución coa introdución de técnicas de investigación moito máis baratas, que serviron para comprender mellor as migracións humanas antigas.

Problemas e erros

Proceso de degradación

Debido a procesos de degradación (como a formación de enlaces cruzados, desaminación e fragmentación) o ADN antigo é de baixa calidade en comparación con material xenético moderno fresco. Os danos característicos e a capacidade do ADNa de sobrevivir ao paso do tempo restrinxe as posibles análises que se poden facer e os lugares onde se pode encontrar a un límite superior de antigüidade para que os traballos coas mostras teñan éxitoAllentoft et al. (2012). Hai unha correlación teórica entre o tempo que pasou e a degradación do ADN,Hebsgaard, M.B., Phillips, M.J. & Willerslev, E., 2005. Geologically ancient DNA: fact or artefact? Trends in microbiology, 13(5), pp.212–220. aínda que as diferenzas nas condicións ambientais nas que se conservaron as mostras complican as cousas. As mostras sometidas a diferentes condicións é improbable que se aliñen ben cunha relación uniforme idade-degradación.Hansen, A.J. et al., 2006. Crosslinks rather than strand breaks determine access to ancient DNA sequences from frozen sediments. Genetics, 173(2), pp.1175–1179. Os efectos ambientais poden incluso ser importantes despois do desenterramento da mostra, xa que a velocidade de degradación do ADN pode incrementarse,Pruvost, M. et al., 2007. Freshly excavated fossil bones are best for amplification of ancient DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(3), pp.739–744. especialmente cando as condicións de almacenamento foron cambiantes.Burger, J. et al., 1999. DNA preservation: a microsatellite-DNA study on ancient skeletal remains. Electrophoresis, 20(8), pp.1722–1728. Mesmo nas mellores condicións de preservación, nai unha fronteira límite superior de 0,4 a 1,5 millóns de anos para unha mostra para que poida conter ADN dabondo como para poder aplicar as tecnoloxías de secuenciación contemporáneas.

As investigacións sobre a descomposición do ADN mitocondrial e ADN nuclear en ósos de moas neozelandesas serviron para facer un modelo da degradación do ADN mitocondrial cunha media de lonxitude de 1 par de bases degradado cada 6 830 000 anos a −5 °C. A cinética da degradación foi medida en experimentos de envellecemento acelerado que tamén mostraron a forte influencia da temperatura e humidade de almacenamento sobre a degradación do ADN. O ADN nuclear degrádase polo menos dúas veces máis rápido que os ADNmt. Entón, nos primeiros estudos que informaron do descubrimento de ADN moito máis antigo, por exemplo de restos de dinosauros do Cretáceo, ese ADN poden tamén proceder da contaminación da mostra.

Límite de idade

Unha revisión fundamental da literatura sobre o ADN antigo desde o inicio do desenvolvemento deste campo salienta que houbo poucos estudos posteriores a 2002 que tivesen éxito en amplificar ADN de restos de antigüidade superior a uns poucos centos de miles de anos. Unha maior ponderación dos riscos da contaminación ambiental e estudos sobre a estabilidade química do ADN tiveron como resultado un maior escepticismo sobre os resultados dos que se informara anteriormente. O ADN que pretendía ser de dinosauro revelouse posteriormente ser ADN contaminante do cromosoma Y humano, mentres que o ADN que se informara que se extraera de halobacterias encapsuladas foi tamén criticado pola súa grande semellanza co de bacterias modernas, o cal apunta a unha posible contaminación. Un estudo de 2007 tamén suxire que estas mostras de ADN bacteriano pode que non sobreviviran desde tempos tan antigos, senón que poderían ser o produto da actividade metabólica de baixo nivel a longo prazo.

O ADNa pode conter un gran número de mutacións post mortem, que se incrementan co tempo. Algunhas rexións de polinucleótidos son máis susceptibles a este degradación, polo que os datos de secuencias poden sortear os filtros estatísticos usados para comprobar a validez dos datos. Debido a erros de secuenciación, debe terse moito coidado ao interpretar o tamaño de poboación. As substitucións causadas por residuos de citosina con desaminación están enormemente sobrerrepresentados nas secuencias de ADN antigo. As codificacións incorrectas de C por T e G por A supoñen a maior parte dos erros.

Contaminación

Outros problemas coas mostras do ADN antigo é a contaminación por ADN humano moderno e por ADN microbiano (a maioría do cal é tamén antigo). Xurdiron novos métodos nos últimos anos para impedir as posibles contaminacións das mostras de ADN, incluíndo as extraccións realizadas en condicións extremadamente estériles, usando adaptadores especiais para identificar moléculas endóxenas da mostra (daquelas que se puideron introducir durante a análise), e aplicando a bioinformática ás secuencias resultantes baseadas en lecturas coñecidas.

ADNa non humano

Malia os problemas asociados co ADN 'antediluviano', foron publicados un amplo e crecente número de secuencias de ADNa de diversos taxons animais e vexetais. Os tecidos examinados inclúen restos animais momificados de forma natural ou artificial, ósos (c.f. Hagelberg et al. 1989; Cooper et al. 1992; Hagelberg et al. 1994), paleofeces, espécimes conservados en alcohol (Junqueira et al. 2002), xacementos de roedores, restos de plantas secas (Goloubinoff et al. 1993; Dumolin-Lapegue et al. 1999) e recentemente, extraccións de ADN de plantas e animais directamente de mostras de solo.

En xuño de 2013, un grupo de investigadores anunciou que secuenciaran o ADN dun cabalo de 560 a 780 miles de anos de antigüidade, usando material extraído dun óso dunha pata atopado enterrado no permafrost do territorio canadense de Yukón.

En 2013, un equipo alemán reconstruíu o xenoma mitocondrial dun oso Ursus deningeri de máis de 300 000 anos de antigüidade, o que proba que pode conservarse ADN antigo auténtico durante centos de miles de anos fóra do permafrost.

En 2016 mediuse o ADN cloroplástico en núcleos de sedimentos mariños, e atopouse ADN de 1,4 millóns de anos. Este ADN tiña unha vida media significativamente máis longa que o de investigación previas, de ata 15 000 anos. O equipo de Kirkpatrick tamén encontrou que o ADN só se degradaba cunha taxa de vida media duns 100 mil anos, e a partir dese punto seguía unha taxa de degradación máis lenta.

ADNa humano

Debido ao considerable interese antropolóxico, arqueolóxico e do público nos restos humanos antigos, estes recibiron moita atención dos investigadores do ADN.

Fontes