miniatura|CRISPR-Cas9
A edición de xenes por CRISPR (adoita pronunciarse crísper) é unha técnica de enxeñaría xenética en bioloxía molecular por medio da cal pode modificarse o xenoma dos organismos vivos. CRISPR é a abreviatura en inglés de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, repeticións palindrómicas curtas agrupadas e espazadas regularmente, unha familia de secuencias de ADN dos procariotas derivadas de fragmentos de bacteriófagos que as infectaran. A técnica está baseada nunha versión simplificada do sistema de defensa antiviral bacteriano CRISPR-Cas9, usado polos procariotas para destruír ADN de bacteriófagos. Con este método, ao introducir nunha célula a nuclease Cas9 en complexo cun ARN guía (ARNg ou, en inglés, gRNA) sintético, pode cortarse o xenoma da célula no lugar desexado, o que permite eliminar xenes existentes ou engadir xenes novos in vivo.
Esta técnica considérase moi importante en biotecnoloxía e medicina, xa que permite editar xenomas in vivo con gran precisión, facilidade e baixo custo. Pode utilizarse na creación de novas medicinas, produtos agrícolas e organismos modificados xeneticamente, ou como medio de controlar patóxenos e pragas. Tamén ten posibilidades no tratamento de enfermidades conxénitas herdadas xeneticamente, así como de doenzas que se orixinan por mutacións somáticas, como o cancro. Porén, o seu uso na modificación xenética da liña xerminal humana é moi polémica. O desenvolvemento da técnica serviulles a Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier para gañar o Premio Nobel de Química de 2020. O terceiro grupo de investigadores que compartiu o premio Kavli polo mesmo descubrimento, liderado por Virginijus Šikšnys, non foi galardoado co premio Nobel.
A nuclease Cas9, que funciona como tesoira xenética, abre ambas as febras dunha secuencia diana de ADN para introducir a modificación por medio dun de dous posibles métodos. As mutacións knock-in, facilitadas por reparación dirixida por homoloxía (HDR), son a vía tradicional usada polas estratexias de edición xenómica dirixida a unha diana. Isto permite a introdución de danos e reparacións no ADN dirixidas a unha diana. A HDR emprega secuencias de ADN similares para reparar as roturas por incorporación de ADN exóxeno que funciona como molde para a reparación. Este método depende de que ocorran danos no ADN periódicos e illados no sitio diana para que comece a reparación. As mutacións knock-out causadas por CRISPR-Cas9 orixínanse pola reparación da rotura de dobre febra no ADN por medio de unión de extremos non homólogos (NHEJ) ou unión de extremos mediada pola POLQ/ polimerase theta (TMEJ). Estas dúas vías de unión de extremos poden con frecuencia orixinar delecións ou insercións aleatorias no sitio de reparación, o cal pode impedir ou alterar o funcionamento do xene. Polo tanto, a enxeñaría xenómica por CRISPR-Cas9 dálle aos investigadores a capacidade de xerar a alteración aleatoria dun xene diana. Debido a isto, a precisión da edición do xenoma é unha gran preocupación. A edición do xenoma orixina cambios irreversibles no xenoma.
Aínda que a edición xenómica en células eucariotas foi posible usando varios métodos desde a década de 1980, os métodos empregados foran ineficientes e pouco prácticos para aplicalos a grande escala. Co descubrimento de CRISPR e especificamente a molécula de nuclease Cas9, a posibilidade dunha edición eficiente e moi selectiva é agora unha realidade. A Cas9 derivada da especie bacteriana Streptococcus pyogenes facilitou a modificación xenómica dirixida a diana en células eucariotas ao permitir un método fiable de crear unha rotura dirixida a un lugar específico designado polas febras guía de ARNtracr (en inglés tracrRNA) e o ARNcr (en inglés crRNA). A facilidade coa cal os investigadores poden inserir a Cas9 e o molde de ARN para silenciar ou causar mutacións puntuais en loci específicos é moi valiosa para un rápido e eficiente mapado de modelos xenómicos e procesos biolóxicos asociados con varios xenes en diversos eucariotas. Desenvolvéronse variantes novas feitas por enxeñaría da nuclease Cas9 que reducen significativamente a actividade fóra de diana.
As técnicas de edición do xenoma CRISPR-Cas9 teñen moitas aplicacións potenciais, incluíndo en medicina e agricultura. O uso do complexo CRISPR-Cas9-ARNg para a edición de xenomas foi elixido pola Asociación Americana para o Avance da Ciencia (AAAS) como descubrimento do ano en 2015. Expresáronse moitas cuestións bioéticas sobre a perspectiva do uso de CRISPR para a edición da liña xerminal, especialmente en embrións humanos.
Historia
Outros métodos A inicios da década de 2000 investigadores alemáns empezaron a desenvolver as nucleases de dedo de cinc (ZFNs), que son proteínas sintéticas cuxos dominios de unión ao ADN lles permiten crear roturas de dobre febra no ADN en sitios específicos. As nucleases de dedo de cinc teñen unha maior precisión e a vantaxe de ser menores que Cas9, pero non se usan tan comunmente coma os métodos baseados en CRISPR. En 2010, as nucleases sintéticas chamadas nucleases efectoras similares a un activador da transcrición (TALENs) proporcionaron un modo máis doado de tomar como diana unha rotura de dobre febra nunha localización específica da febra de ADN. Tanto as nucleases de dedo de cinc coma as TALENs requiren o deseño e creación dunha proteína á medida para cada secuencia diana de ADN, o cal é un proceso moito máis difícil e leva máis tempo que deseñar ARNs guías. Os CRISPRs son moito máis fáciles de deseñar porque o proceso require sintetizar só unha curta secuencia de ARN, un procedemento que xa se usa moito noutras técnicas de bioloxía molecular (por exemplo, para crear cebadores oligonucleótidos).
Mentres que métodos como a interferencia de ARN (RNAi) non suprimen totalmente a función xénica, CRISPR, as ZFNs e as TALENs proporcionan un knockout de xenes completo e irreversible. CRISPR pode tamén tomar como diana varios sitios do ADN simultaneamente simplemente introducindo diferentes ARNg. Ademais, o custo de empregar CRISPR é relativamente baixo.
Descubrimento
En 2012 Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier, Martin Jínek, Krzysztof Chyliński, Ines Fonfara e Michael Hauer publicaron os seus descubrimentos de que o CRISPR-Cas9 podía programarse con ARN para editar o ADN xenómico, agora considerado un dos descubrimentos máis significativos na historia da bioloxía.
Patentes e comercialización As patentes parqa CRISPR pasaron por varias vicisitudes.
En novembro de 2013, SAGE Labs (parte do grupo Horizon Discovery) tiña dereitos exclusivos dunha desas compañías para producir e vender ratos modificados xeneticamente e dereitos non exclusivos sobre modelos de ratos e coellos. En 2015 Thermo Fisher Scientific tiña licenza de propiedade intelectual de ToolGen para desenvolver kits de reactivos CRISPR.
En decembro de 2014 os dereitos de patente para CRISPR foron impugnados. Formáronse varias compañías para desenvolver fármacos e ferramentas de investigación. A medida que as compañías incrementaron o seu financiamento, empezaron a formularse dúbidas sobre se o CRISPR podería ter un rendemento económico rápido. En 2014 Feng Zhang do Broad Institute do MIT e Harvard e outros nove recibiron a patente estadounidense número 8.697.359 sobre o uso da edición de xenes por CRISPR–Cas9 en eucariotas. Aínda que Charpentier e Doudna (grupo CVC) foron recoñecidos como os que concibiron CRISPR, o Broad Institute foi o primeiro que conseguiu unha "redución á práctica" de acordo cos xuíces e xuízas da patente Sally Gardner Lane, James T. Moore e Deborah Katz.
O primeiro conxunto de patentes concedéuselle ao equipo do Broad Institute en 2015, o que motivou que os avogados do grupo CVC interpuxesen o primeiro procedemento de interferencia. En febreiro de 2017 a Oficina de Patentes dos EUA (USPTO) xulgou un caso de interferencia de patente presentado pola Universidade de California con respecto a patentes concedidas ao Broad Institute, e atopou que as patentes de Broad, que afirmaban comprendían a aplicación de CRISPR-Cas9 en células eucariotas, eran distintas das invencións aducidas pola Universidade de California.
Pouco despois, a Universidade de California presentou unha apelación a este pronunciamento. En 2019 iniciouse un segundo preito de interferencia. Foi unha resposta a aplicacións da patente feitas por CVC que solicitou ao tribunal de apelación determinar cal era o inventor orixinal desta tecnoloxía. A USPTO sentenciou en marzo de 2022 contra a Universidade de California, establecendo que o Broad Institute foi o primeiro en rexistrala. A decisión afectou moitos dos acordos de licenzas para a tecnoloxía de edición por CRISPR que foran concedidas pola Universidade de Californa, Berkeley. A Universidade de California declarou a súa intención de apelar o ditame ao USPTO.
En Europa En marzo de 2017 a Oficina de Patentes Europea (OPE) anunciou a súa intención de dar dereito de editar todos os tipos de células ao Instituto Max-Planck de Berlín, á Universidade de California e á Universidade de Viena, e en agosto de 2017, a OPE anunciou a súa intención de dar dereitos sobre CRISPR nunha aplicación de patente presentada por MilliporeSigma. En agosto de 2017 a situación da patente en Europa era complexa, con MilliporeSigma, ToolGen, a Universidade de Vilnius e Harvard disputándose os dereitos, xunto coa Universidade de Califora e Broad.
En xullo de 2018, o Tribunal Europeo de Xustiza sentenciou que a edición de xenes de plantas era unha subcategoría dos alimentos OMG e, polo tanto, que a técnica CRISPR sería regulada de aí en adiante na Unión Europea polas súas regras e regulacións para os organismos modificados xeneticamente (OMG).
Sucesos recentes En febreiro de 2020, un ensaio en EUA mostrou que a edición de xenes por CRISPR era segura en tres pacientes de cancro.
En outubro de 2020 as investigadoras Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna recibiron o Premio Noble de Química polo seu traballo no campo dos CRISPR. Fixeron historia por ser as dúas primeiras mulleres que compartiron este premio sen compartilo tamén cun home.
En xuño de 2021 concluíu un primeiro pequeno ensaio clínico da edición de xenes por CRISPR intravenosa en humanos con resultados prometedores.
En setembro de 2021 o primeiro alimento editado con CRISPR saíu á venda pública no Xapón. Eran uns tomates modificados xeneticamente para teren unhas cinco veces a cantidade normal do neurotransmisor con posible efecto calmante GABA (un neurotransmisor inhibitorio). CRISPR fora aplicado por primeira vez en tomates en 2014.
En decembro de 2021 informouse de que o primeiro alimento animal mariño con edición de xenes por CRISPR e un un segundo conxunto de alimentos editados con CRISPR saíron á venda no Xapón: creáronse dous peixes, un dos cales crecía case o dobre do normal, pola alteración da leptina, a cal controla o apetito, e o outro crecía ao 1,2 do seu tamaño natural coa mesma cantidade de comida debido á alteración da miostatina, que inhibe o crecemento muscular.
Un estudo de 2022 sobre a preferencia dos consumidores de comprar tomates CRISPR atopou que darlles a coñecer máis sobre os tomates CRISPR tivo un forte efecto positivo sobre a prefeencia dos participantes. "Case a metade dos 32 participantes de Alemaña que eran científicos demostraron eleccións constantes, mentres que a maioría mostrou un aumento na súa intención de comprar tomates CRISPR, principalmente non científicos."
A Universidade de California, Berkeley anunciou en maio de 2021 o seu intento de poxa de token non funxible de ambas as patentes de edición de xenes por CRISPR así como da inmunoterapia do cancro, aínda que a universidade conservaría neste caso a propiedade das patentes. O 85 % dos fondos reunidos polas vendas da colección chamada The Fourth Pillar (O cuarto piar) ían ser utilizados para financiar investigacións. Vendeuse en xuño de 2022 por 54.000 dólares.
Enxeñaría xenómica