miniatura|dereita|500px|Ciclo do ácido cítrico ou de Krebs. O ciclo do ácido cítrico, tamén chamado ciclo de Krebs ou ciclo do ácido tricarboxílico, é un ciclo de reaccións metabólicas catalizadas encimaticamente, que forma unha parte central da respiración celular, por medio da cal a maioría dos seres vivos oxidan os substratos para obter a enerxía que necesitan para vivir. Nas células eucariotas, o ciclo do ácido cítrico ten lugar na matriz das mitocondrias e nas bacterias no citoplasma. Os compoñentes e reaccións do ciclo do ácido cítrico foron primeiramente estudados polo investigador húngarohttp://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1937/szent-gyorgyi-bio.html e premio Nobel Albert Szent-Györgyi, e posteriormente o premio Nobel Hans Adolf Krebs, un xudeu alemán refuxiado en Gran Bretaña, ampliou eses estudos e postulou por primeira vez o ciclo.
Nos organismos aerobios o ciclo do ácido cítrico é parte dunha vía metabólica implicada na conversión química dos carbohidratos, lípidos e proteínas en dióxido de carbono e auga para xerar unha forma de enerxía utilizable pola célula, chamada respiración aerobia. Outras vías previas ao ciclo do ácido cítrico no caso do metabolismo dos carbohidratos son a glicólise e a descarboxilación do piruvato, que subministran os metabolitos que entran no ciclo. Despois do ciclo do ácido cítrico ten lugar a fosforilación oxidativa, na que se obtén enerxía. Ademais, o ciclo do ácido cítrico proporciona moléculas precursoras que entran noutras vías metabólicas, como a da síntese dalgúns aminoácidos, polo que é funcional mesmo en células que teñen un metabolismo fermentativo. A súa posición central para moitas vías biosintéticas fai pensar que foi un dos primeiros ciclos de reaccións do metabolismo xurdidos na evolución, e puido formarse nas primeiras etapas da orixe da vida abioxeneticamente.Lane, Nick (2010), "Life Ascending: the 10 great innovations of evolution" (Profile)
Visión xeral do ciclo No ciclo de Krebs entan grupos de dous carbonos procedentes dos substratos que se van oxidar, que chegan ao ciclo unidos ao coencima A (ou CoA) en forma de acetil-CoA. O ciclo do ácido cítrico empeza coa transferencia do grupo acetilo de dous carbonos do acetil-CoA a unha molécula de oxalacetato (de 4 carbonos), orixinándose unha molécula de 6 carbonos chamada citrato (ácido cítrico ionizado). O citrato é a primeira molécula formada no ciclo e é un ácido con tres grupos carboxilo ou -COOH, polo que é un ácido tricarboxílico. De aí veñen os nomes de ciclo do ácido cítrico ou ciclo do ácido tricarboxílico. O citrato experimenta despois unha serie de transformacións químicas, nas que perde dous dos seus grupos carboxilo en forma de dióxido de carbono (este CO2, xunto co formado na descarboxilación do piruvato previa, é o CO2 que se desprende na respiración e que será expulsado polos pulmóns, branquias, estomas das follas das plantas...). Os carbonos que se desprenden como dúas moléculas de CO2 formaban parte do oxalacetato preexistente, non (directamente) do acetil-CoA. Os carbonos doados polo acetil-CoA pasarán formar parte do oxalacetato que se rexenera ao final da primeira volta do ciclo, e non se perderán como CO2 ata as posteriores voltas do ciclo, a non ser que os intermediarios do ciclo se desvíen a outras vías metabólicas do anabolismo. Moitas das reaccións do ciclo supoñen unha perda de electróns e hidróxenos para os metabolitos intermedios, polo que se oxidan. Estes electróns e hidróxenos ricos en enerxía son recollidos polos coencimas NAD+ e FAD, que se converten en NADH e FADH2. Por cada grupo acetilo que entra no ciclo, prodúcense tres moléculas de NADH e unha de FADH2 (o FADH2, que é un grupo prostético que non se pode desprender do seu encima, cede os electróns despois ao coencima Q, formando QH2). Nunha das reaccións do ciclo ten lugar unha fosforilación a nivel de substrato, que orixina o nucleótido enerxético GTP, que se pode transformar encimaticamente en ATP, polo que hai unha formación directa de moléculas enerxéticas no ciclo. O resto da enerxía extraída dos substratos vaise producir nas fases posteriores ao ciclo, chamadas transporte de electróns da cadea de transporte electrónico e fosforilación oxidativa, xa que os coencimas producidos no ciclo ceden os seus electróns á cadea de transporte electrónico e iso ten como resultado a produción de grandes cantidades de ATP. Ao final do ciclo rexenérase o oxalacetato que comezara o ciclo, que deste modo pode volver a entrar noutra volta do ciclo.
En resumo, en cada volta do ciclo entra un grupo acetilo de dous carbonos e prodúcense dous CO2, un GTP e catro moléculas de coencimas reducidos. O CO2 será expulsado do organismo, o GTP transformado en ATP e utilizado como fonte enerxética, e os coencimas cederán os seus electróns posteriormente á cadea de transporte electrónico para producir ATP.
Reaccións do ciclo A reacción neta xeral de todo o ciclo é: acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + ADP + Pi → CoA + 3 NADH + H+ + FADH2 + ATP + 2 CO2
Ao ciclo deben chegar continuamente grupos acetilo de dous carbonos traídos polo CoA en forma de acetil-CoA. No ciclo interveñen 8 encimas. Varios dos encimas do ciclo poden estar feblemente asociados formando complexos multiencimáticos na matriz mitocondrial. Os encimas están no seo da matriz mitocondrial, menos a succinato deshidroxenase, que está unida á cara interna da membrana mitocondrial interna. Os intermediarios son diversas moléculas de ácidos e oxoácidos de 4 a 6 átomos de carbono, que están ionizadas a pH celular, por iso falamos de citrato, malato, fumarato... en vez de ácidos cítrico, málico, fumárico... Deben intervir diversos coencimas, como o CoA, NAD, FAD ou GDP e ións catalizadores. Por cada acetil-CoA que entra no ciclo fórmanse dúas moléculas de CO2. a enerxía desprendida das reaccións "almacénase" por medio da formación dunha molécula de GTP e catro de coencimas reducidos (3 NADH e 1 FADH2). Os coencimas cederán despois esa enerxía transferindo os electróns á cadea de transporte electrónico. Como o coencima FADH2 está unido covalentemente ao seu encima (é un grupo prostético), cede os seus electróns ao coencima Q (pasa a QH2), que é o aceptor final da reacción e o intermediario que pasa os electróns á cadea de transporte electrónico (en realidade o encima está unido á membrana mitocondrial interna e forma parte do complexo II da cadea de transporte electrónico).
A continuación unha táboa resumo coas principais características das reaccións do ciclo, e despois unha análise máis detallada de cada reacción.
SubstratosProdutosEncimaTipo de reacciónComentario1Oxalacetato +Acetil-CoA +H2OCitrato +CoA-SHCitrato sintasecondensaciónirreversible, a molécula de 4C (oxalacetato) convértese noutra de 6C (citrato)2Citratocis-aconitato +H2OAconitase Deshidrataciónisomerización reversible3cis-Aconitato +H2OIsocitratoHidratación4Isocitrato +NAD+Oxalosuccinato +NADH + H +Isocitrato deshidroxenaseOxidaciónxera NADH (equivale a 2,5 ATP aproximadamente)5Oxalosuccinatoα-cetoglutarato +CO2Descarboxilaciónreacción limitante, paso irreversible, xera unha molécula de 5C6α-cetoglutarato +NAD+ +CoA-SHSuccinil-CoA + NADH + H+ + CO2α-cetoglutarato deshidroxenasedescarboxilaciónoxidativapaso irreversible, xera NADH (equivale a uns 2,5 ATP), rexenera a cadea de 4C (excluído o CoA)7Succinil-CoA + GDP + PiSuccinato +CoA-SH +GTPSuccinil-CoA sintetasefosforilación a nivel de substratoou ADP→ATP en vez de GDP→GTP,xera 1 ATP ou equivalente8Succinato + ubiquinona (Q)Fumarato + ubiquinol (QH2)Succinato deshidroxenaseOxidaciónusa FAD como grupo prostético (FAD→FADH2 no primeiro paso da reacción) no encima, xera o equivalente a uns 1,5 ATP9Fumarato + H2OL-MalatoFumaraseadición de H2O(hidratación)10L-Malato + NAD+Oxalacetato + NADH + H+Malato deshidroxenaseOxidaciónreversible (de feito, o equilibrio favorece o malato), xera NADH (equivalente a uns 2,5 ATP)
As mitocondrias nos animais, incluídos homes, posúen dúas succinil-CoA sintetases: unha que produce GTP a partir de GDP, e outra que produce ATP a partir de ADP. As plantas teñen o tipo que produce ATP. O GTP que forma a succinil-CoA sintetase pode utilizalo a nucleósido-difosfato quinase para formar ATP, catalizando a reacción: GTP + ADP → GDP + ATP.
Reacción 1: citrato sintase
miniatura|ΔG'°=-31,4 kJ/molA citrato sintase cataliza a condensación do oxalacetato co acetil-CoA na que se obtén citrato e se libera CoA. A estrutura cuaternaria deste encima consta de dúas subunidades, a cada unha das cales se poden unir os dous substratos.
O sitio activo do encima activa o acetil-CoA para facelo afín a un centro carbonoso do oxalacetato. A continuación, únense os dous substratos con rotura do enlace tioéster do CoA por hidrólise, formando así o citrato.
A reacción é moi exergónica (ΔG'°=-31,4 kJ/mol), polo que é irreversible. O cirato producido polo encima, é un inhibidor competitivo do encima. Deste modo o encima pode ser regulado estritamente, funcionando como a reacción limitante de todo o ciclo.miniatura|Na imaxe en cada un dos monómeros da citrato sintase unida a unha molécula de oxalacetato (maxenta) e unha dun análogo do acetil-CoA (branco).C. Usher, J. Remington, P. Martin, G. Drueckhammer, A very short hydrogen bond provides only moderate stabilization of an enzyme-inhibitor complex of citrate synthase. In: Biochemistry 33, S. 7753-7759, 1994
Reacción 2: aconitase
miniatura|ΔG'°=+6,3 kJ/molA aconitase cataliza a isomerización do citrato a isocitrato (por medio da formación do cis-aconitato). O encima cataliza tamén a reacción inversa, pero no ciclo do ácido cítrico esta reacción é unidireccional a causa da lei de acción de masas: as concentracións (en condicións estándar) de citrato (91%), do intermediato cis-aconitato (3%) e de isocitrato (6%), impulsan a reacción claramente cara á produción de isocitrato.
No sitio activo do encima está presente un grupo fero-sulfurado que, xunto con algúns residuos de aminoácidos polares, únese ao substrato. No centro activo os residuos de serina, arxinina, histidina e aspartato permiten a unión estereoespecífica do citrato 1R,2S exclusivamente, rexeitando a forma oposta.dereita|miniatura|Estrutura da aconitaseH. Lauble, C. D. Stout: Steric and conformational features of the aconitase mechanism. In: Proteins 22, S. 1-11, 1995.
Reacción 3: isocitrato deshidroxenase miniatura|ΔG'°=-8,4 kJ/molA isocitrato deshidroxenase mitocondrial é un encima dependente do NAD+ e de Mn2+ e/ou Mg2+. Inicialmente, o encima cataliza a oxidación do isocitrato a oxalosuccinato, que xera unha molécula de NADH. Despois, a presenza dun ión bivalente que acomplexa os osíxenos do grupo carboxilo en posición alfa aumenta a electronegatividade desa rexión da molécula. Isto xera unha redistribución dos electróns da molécula, coa conseguinte rotura do enlace entre o carbono en posición gamma e o grupo carboxilo adxacente. Deste modo prodúcese unha descarboxilación (é dicir, a liberación dun CO2 procedente do grupo -COOH), que leva á formación de α-cetoglutarato, molécula caracterizada por ter un grupo carboxilo en cada extremo e unha cetona en posición alfa respecto a un dos dous grupos carboxilo.miniatura|Estrutura da isocitrato deshidroxenase de Escherichia coli.Mesecar, A.D., Stoddard, B.L., Koshland Jr., D.E. Orbital steering in the catalytic power of enzymes: small structural changes with large catalytic consequences. Science v277 pp.202-206, 1997
Reacción 4: α-cetoglutarato deshidroxenase