miniatura|300px|Representación xeral do método utilizado para producir anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais (ás veces abreviados como Acmo, mAb ou moAb) son anticorpos monoespecíficos que son todos idénticos porque os producen células inmunitarias idénticas que son clons dunha única célula parental. Por tanto, os anticorpos monoclonais teñen todos as mesmas zonas de unión ao antíxeno, é dicir, teñen unha afinidade monovalente, xa que todos se unen o mesmo epitopo do antíxeno. A diferenza dos anteriores, os anticorpos policlonais son producidos por varios clons diferentes de células inmunitarias e non son idénticos.
É posible producir anticorpos monoclonais para case calquera substancia, que se unirán especificamente a esa substancia, e poden despois servir para detectar ou purificar esa substancia. Convertéronse nunha importante ferramenta en bioquímica, bioloxía molecular e medicina. Cando se usan como medicinas, o nome non propietario da droga acaba en -mab (do inglés monoclonal antibody).
Descubrimento A idea da posibilidade de producir unha "bala máxica" contra as enfermidades infecciosas foi inicialmente proposta por Paul Ehrlich, quen, a principios do século XX, postulou que, se podía producirse un composto que se dirixise selectivamente contra o organismo causante dunha enfermidade, entón podía administrarse xunto con ese composto de unión selectiva unha toxina contra ese organismo que o matase. Ehrlich e Ilya Metchnikoff recibiron o Premio Nobel de Medicina de 1908 por este traballo, que levou a atopar un tratamento efectivo contra a sífilis en 1910.
Na década de 1970, comprendeuse que no mieloma múltiple, un cancro de células B, ditas células producían todas un único tipo de anticorpo (unha paraproteína). Estes anticorpos utilizáronse para estudar a estrutura dos anticorpos, pero daquela non era posible producir anticorpos idénticos específicos contra un determinado antíxeno.
A produción de anticorpos monoclonais utilizando células híbridas de humano-rato describiuna Jerrold Schwaber en 1973Schwaber, J.; Cohen, E. P. (1973). "Human x mouse somatic cell hybrid clone secreting immunoglobulins of both parental types". Nature 244 (5416): 444–447. Bibcode 1973Natur.244..444S. doi:10.1038/244444a0. PMID 4200460. e, aínda que foi moi citado nos traballos sobre hibridomas,Science Citation Index a prioridade do descubrimento suscitou controversia.Cambrosio, A.; Keating, P. (1992). "Between fact and technique: the beginnings of hybridoma technology". Journal of the History of Biology 25 (2): 175–230. doi:10.1007/BF00162840. PMID 11623041. A invención foi concibida por George Pieczenik, con John Sedat (marido da investigadora Elizabeth Blackburn) como testemuña e posto en práctica por Cotton e Milstein, e despois por Kohler e Milstein. En 1984 Georges Köhler, César Milstein, e Niels Kaj JerneKöhler, G.; Milstein, C. (1975). "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256 (5517): 495–497. Bibcode 1975Natur.256..495K. doi:10.1038/256495a0. PMID 1172191. compartiron o premio Nobel de Medicina. A idea chave foi usar unha liña de células de mieloma que perdera a capacidade de segregar anticorpos, para elaborar unha técnica para fusionar estas células con células B sas produtoras de anticorpos, e seleccionar as células fusionadas exitosamente.
En 1988, Greg Winter e o eu equipo foron pioneiros das técnicas para humanizar anticorpos monoclonais, o que evitaba as reaccións que moitos anticorpos monoclonais causaban nalgúns pacientes.
Produción miniatura|Investigadores examinando preparacións de cultivos de células que producen anticorpos monoclonais, para seleccionar as máis apropiadas. miniatura|En cultivos celulares poden producirse as cantidades de anticorpos monoclonais que sexan precisas.
Produción de células de hibridoma Os anticorpos monoclonais fanse tipicamente fusionando células de mieloma humano con células de bazo de rato que foi previamente inmunizado co antíxeno desexado. Porén, avances recentes permitiron usar células B de coello para formar un hibridoma de coello.
Utilízase polietilenglicol para fusionar as membranas plasmáticas adxacentes, pero a taxa de éxito é baixa polo que se usa un medio selectivo no cal só poden crecer as células fusionadas. Isto é posible porque as células de mieloma perderon a capacidade de sintetizar hipoxantina-guanina-fosforribosil transferase (HGPRT), un encima necesario nunha ruta de síntese de ácidos nucleicos (ruta de salvamento). A ausencia de HGPRT non é un problema para estas células a non ser que a ruta de síntese de novo de purinas estea tamén interrompida. Ao expoñer as células á aminopterina (un análogo do ácido fólico, que inhibe a dihidrofolato redutase, DHFR), estas non poden usar a ruta de novo e converterse en totalmente auxotróficas para os ácidos nucleicos, é dicir, que os requiren como un suplemento para poder vivir.
O medio de cultivo selectivo para as células fusionadas (hibridomas) chámase medio HAT porque contén hipoxantina, aminopterina, e timidina. As células de mieloma que non se fusionaron non poden crecer porque carecen do mencionado encima HGPRT, e dese modo non poden replicar o seu ADN. As células de bazo non fusionadas tampouco poden crecer indefinidamente debido á duración limitada da súa vida (non son cancerosas). Só as células fusionadas híbridas (hibridomas), poden crecer indefinidamente no medio porque a parte correspondente á célula de bazo coa que se fusionaron fornece o encima HGPRT e porque a parte correspondente á célula de mieloma ao ser tumoral fai ao hibridoma potencialmente inmortal.
Esta mestura de células dilúese despois e cos clons fanse cultivos celulares a partir dunha soa célula parental en pociños de microtitulación. Compróbase despois a capacidade dos anticorpos segregados por diferentes clons de unirse ao antíxeno (cunha proba chamada ELISA ou un Ensaio de Micromatrices de Antíxenos) ou inmuno-dot blot. O clon máis produtivo e estable será o seleccionado para ulteriores usos.
Os hibridomas poden cultivarse indefinidamente nun medio de cultivo axeitado. Poden tamén inxectarse na cavidade peritoneal dun rato. Alí, producirán tumores que segregarán un fluído rico en anticorpos chamado fluído ascítico.
O medio debe enriquecerse durante a selección in vitro para favorecer o crecemento do hibridoma. Isto pode facerse usando unha capa celular de fibrocitos alimentadores ou cun medio suplementador como o briclone. Tamén se pode usar medio de cultivo condicionado por macrófagos. A produción en cultivo celular é normalmente a preferida xa que a técnica da ascite é dolorosa para o animal, e considérase pouco ética ao existir unha alternativa válida.
Purificación de anticorpos monoclonais Os anticorpos desexados poden obterse a partir dunha mostra do medio dos hibridomas en cultivo ou ben do fluído ascítico. Os contaminantes presentes na mostra do cultivo celular serán principalmente compoñentes do medio como factores de crecemento, hormonas, e transferrinas. Polo contrario, nas mostras tomadas in vivo é probable atopar anticorpos do hóspede, proteases, nucleases, ácidos nucleicos, e virus. En ambos os casos, pode haber outras secrecións do hibridoma como citocinas. Podería haber tamén contaminación bacteriana e, como resultado desta, endotoxinas segregadas polas bacterias. Dependendo da complexidade do medio requirido para o cultivo celular e dos contaminantes implicados, pode ser preferible un método ou outro (in vivo ou in vitro).
A mostra debe ser primeiro acondicionada ou preparada para a purificación. Primeiro elimínanse as células, restos celulares, lípidos, e material coagulado, xeralmente por centrifugación seguida de filtración cun filtro de 0,45 µm. Estas partículas grandes poden causar en pasos posteriores da purificación un fenómeno chamado incrustación de membrana (membrane fouling, depósito de partículas ou solutos sobre a superficie da membrana de filtración, que alteran as súas propiedades). Ademais, a concentración do produto na mostra pode non ser suficiente, especialmente en casos onde o anticorpo desexado é producido por unha liña celular de baixa secreción. Xa que logo, a mostra condénsase por ultrafiltración ou diálise.
A maioría das impurezas con carga eléctrica son anións como ácidos nucleicos e endotoxinas. Estes anións sepáranse a miúdo por cromatografía de intercambio iónico. Pode usarse a cromatografía de intercambio de catións a un pH o suficientemente baixo como para que o anticorpo desexado se una á columna mentres que os anións flúen a través dela, ou ben a creomatografía de intercambio de anións a pH o suficientemente elevados como para que o anticorpo desexado flúa a través da columna e os anións queden unidos a ela. Poden separarse tamén varias proteínas xunto cos anións baseándose no seu punto isoeléctrico (pI). Por exemplo, a albumina ten un pI de 4,8, o cal é significativamente máis baixo ca o da maioría dos anticorpos monoclonais, os cales teñen un pI de 6,1. Noutras palabras, a un pH dado, a carga media das moléculas de albumina é probablemente máis negativa. A transferrina, pola súa parte, ten un pI de 5,9, polo que non pode separarse doadamente por este método. Cómpre unha diferenza no pI de polo menos 1 para que se produza unha boa separación.
A transferrina pode ser retirada da mestura por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. A vantaxe deste método de purificación é que é unha das técnicas cromatográficas máis fiables. Como estamos a tratar con proteínas, propiedades como a carga e a afinidade non son consistentes e varían co pH a medida que as moléculas van sendo protonadas ou desprotonadas, mentres que, polo contrario, o tamaño permanece relativamente constante. Porén, ten tamén inconvenientes, como a baixa resolución, baixa capacidade de resolución e baixa capacidade e baixos tempos de elución.
Un método de separación moito máis rápido e dun só paso é a cromatografía de afinidade con Proteína A/G (a Proteína A/G é unha proteína de fusión recombinante que combina dominios de unión a IgG das Proteínas A e G, usadas nas técnicas inmunolóxicas, e que se pode unir a anticorpos IgG). O anticorpo únese selectivamente á Proteína A/G, polo que se obtén un elevado nivel de pureza (xeralmente >80%). Porén, este método pode ser problemático aplicado a anticorpos que se danen facilmente, xa que normalmente nesta técnica hai que usar condicións duras. Un pH baixo pode romper enlaces e retirar o anticorpo da columna. Ademais de afectar posiblemente ao produto, os pHs baixos poden causar que a propia Proteína A/G se escape da columna e apareza na mostra final da elución. Tamén se dispón de sistemas tamponados de elución suaves que empregan altas concentracións salinas, que evitan que os anticorpos sensibles se teñan que expoñer a pHs baixos. O custo é tamén unha consideración importante neste método porque a Proteína A/G inmobilizada é unha resina máis cara.
A purificación de afinidade pode utilizarse para atinxir a máxima pureza nun só paso, utilizando o antíxeno para proporcionar unha gran especificidade polo anticorpo. Neste método, o antíxeno usado para xerar o anticorpo está unido covalentemente a un soporte de agarosa. Se o antíxeno é un péptido, sintetízase xeralmente de modo que teña unha cisteína terminal, a cal permitirá unha unión selectiva á proteína portadora, como a hemocianina da lapa Megathura crenulata KLH (keyhole limpet hemocyanin) durante o desenvolvemento e ao soporte para a purificación. O medio que contén o anticorpo incúbase despois co antíxeno inmobilizado, ou ben en lotes ou ben a medida que o anticorpo pasa pola columna, na que se unirá selectivamente e quedará retido, mentres que as impurezas son lavadas columna abaixo. Despois faise unha elución cun tampón de pH baixo ou un tampón de elución moi salino, que é máis suave, para recuperar o anticorpo purificado adherido ao soporte.