Este artigo trata da técnica laboratorial. Para tratamentos médicos, ver diálise renal e diálise hepática. Para o tratamento de água, ver osmose inversa. Para outras utilizações, consulte diálise.
miniatura|Diálise de pequenas moléculas utilizando tubos de diálise Em química e bioquímica, diálise é o processo de separação de moléculas em solução pela diferença nas suas taxas de difusão através de uma membrana semipermeável, como um tubo de diálise.
A diálise é uma técnica laboratorial comum que funciona com o mesmo princípio que a diálise renal. No campo da investigação em ciências da vida, a aplicação mais comum da diálise é a remoção de pequenas moléculas indesejadas, como sais, agentes redutores ou corantes, de grandes macromoléculas, como proteínas, ADN ou polissacáridos. A diálise é também frequentemente utilizada para estudos de troca de tampão e ligação de fármacos.
O conceito de diálise foi introduzido em 1861 pelo químico escocês Thomas Graham. Graham utilizou esta técnica para separar os solutos sacarose (uma molécula pequena) e goma arábica (uma molécula grande) em solução aquosa. Denominou os solutos difusíveis de cristalóides e os que não atravessavam a membrana de colóides.
Com base neste conceito, a diálise pode ser definida como um processo de separação espontânea de partículas coloidais em suspensão, desde iões dissolvidos a pequenas moléculas, através de uma membrana semipermeável. Uma membrana de diálise é geralmente feita de celulose, celulose modificada ou um polímero sintético (acetato de celulose ou nitrocelulose).
Etimologia O termo diálise deriva do grego διά, que significa "através de", e λύειν, que significa "soltar, afrouxar".
Princípios A diálise é o processo utilizado para alterar a matriz de moléculas numa amostra, diferenciando as moléculas através da separação por tamanho. Depende da difusão, que é o movimento térmico aleatório das moléculas em solução (movimento browniano) que provoca o movimento líquido das moléculas de uma área de maior concentração para outra de menor concentração até que o equilíbrio seja atingido. Devido ao tamanho dos poros da membrana, as moléculas grandes da amostra não conseguem atravessá-la, o que restringe a sua difusão da câmara de amostra. Em contraste, as moléculas pequenas podem difundir-se livremente através da membrana e atingir o equilíbrio em todo o volume da solução, o que altera a concentração global destas moléculas na amostra e no dialisante (ver figura de diálise à direita).
A osmose é outro princípio que faz com que a diálise funcione. Durante a osmose, o fluido desloca-se das zonas de maior concentração de água através de uma membrana semipermeável até que o equilíbrio seja atingido. Na diálise, o excesso de fluido move-se da amostra para o dialisante através da membrana até que o nível do fluido se iguale na amostra e no dialisante.
Por fim, a ultrafiltração é o fluxo convectivo de água e solutos dissolvidos a favor de um gradiente de pressão causado por forças hidrostáticas ou osmóticas. Na diálise, a ultrafiltração remove as moléculas residuais e o excesso de fluido da amostra.
Por exemplo, a diálise ocorre quando uma amostra contida numa bolsa de celulose é mergulhada numa solução de diálise. Durante a diálise, é atingido um equilíbrio entre a amostra e o dialisante, uma vez que apenas as moléculas pequenas conseguem atravessar a membrana de celulose, deixando apenas as partículas maiores para trás.
Uma vez atingido o equilíbrio, a concentração final de moléculas depende dos volumes das soluções envolvidas e, se o dialisante equilibrado for substituído (ou trocado) por dialisante fresco (ver procedimento abaixo), a difusão reduzirá ainda mais a concentração de moléculas pequenas na amostra.
A diálise pode ser utilizada para introduzir ou remover pequenas moléculas de uma amostra, uma vez que estas moléculas se movem livremente através da membrana em ambas as direções. A diálise também pode ser utilizada para remover sais. Isto torna a diálise uma técnica útil para diversas aplicações. Consulte tubos de diálise para obter mais informações sobre a história, as propriedades e o fabrico das membranas semipermeáveis utilizadas para diálise.
Tipos
Diálise por difusão A diálise por difusão é um processo de separação espontânea em que a força motriz para a separação é o gradiente de concentração. Apresenta um aumento da entropia e uma diminuição da energia livre de Gibbs, o que significa que é termodinamicamente favorável. A diálise por difusão utiliza membranas de permuta aniónica ou membranas de permuta catiónica, dependendo dos compostos a separar. As membranas de permuta aniónica permitem a passagem de aniões enquanto impedem a passagem de catiões devido à repulsão co-iónica e à preservação da neutralidade elétrica. O oposto é verdade para as membranas de permuta catiónica.
Eletrodiálise A eletrodiálise é um processo de separação que utiliza membranas de permuta iónica e um potencial elétrico como força motriz. É utilizada principalmente para remover iões de soluções aquosas. Existem três processos de eletrodiálise habitualmente utilizados: diálise de Donnan, eletrodiálise inversa e eletroeletrodiálise. Estes processos são explicados a seguir. Diálise de Donnan
A diálise de Donnan é um processo de separação utilizado para trocar iões entre duas soluções aquosas separadas por membranas de permuta catiónica ou aniónica. No caso de uma membrana de permuta catiónica que separa duas soluções com acidez diferente, os protões (H⁺) atravessam a membrana em direção ao lado menos ácido. Isto induz um potencial elétrico que provoca um fluxo de catiões presentes no lado menos ácido para o lado mais ácido. O processo termina quando a variação da concentração de H⁺ é da mesma ordem de grandeza que a diferença da concentração dos catiões separados.
Eletrodiálise Inversa A eletrodiálise inversa é uma tecnologia baseada em membranas que extrai eletricidade de uma mistura de duas correntes de água com diferentes salinidadess. Normalmente, utiliza membranas de permuta aniónica ou catiónica. As membranas de permuta aniónica permitem a passagem de aniões e impedem a passagem de catiões, enquanto as membranas de permuta catiónica fazem o contrário. Os catiões e os aniões na água de elevada salinidade movem-se em direção à água de menor salinidade, com os catiões a passarem pelas membranas de troca catiónica e os aniões pelas membranas de troca aniónica. Este fenómeno pode ser convertido em eletricidade.
Electro-electrodiálise A eletro-eletrodiálise é um processo eletromembranar de três compartimentos que combina a eletrodiálise e a eletrólise. É frequentemente utilizada para recuperar ácido de uma solução utilizando membranas de permuta aniónica e catiónica e eletrólise. Os três compartimentos estão separados por duas barreiras, que são membranas de permuta iónica. O compartimento central contém a água a tratar. Os compartimentos laterais contêm água pura. Os aniões passam através da membrana de permuta aniónica, enquanto os catiões passam através da membrana de permuta catiónica. A eletricidade cria H+ no lado aniónico e OH− no lado catiónico, que reagem com os respetivos iões. Procedimento
Equipamento Separar moléculas numa solução é um processo relativamente simples. Para além do lisado e do tampão de diálise, normalmente só é necessário: Uma membrana de diálise no formato adequado (por exemplo, tubos, cassetes, etc.) e um limite de corte de peso molecular.
Um recipiente para armazenar o tampão de diálise.
A capacidade de agitar as soluções e controlar a temperatura.
Protocolo geral Um procedimento típico de diálise para amostras de proteínas é o seguinte: Prepare a membrana de acordo com as instruções.
Coloque a amostra no tubo, cassete ou aparelho de diálise.
Coloque a amostra numa câmara exterior com tampão de diálise (agitando suavemente o tampão).
Dialise durante duas horas (à temperatura ambiente ou 4 °C).
Troque o tampão de diálise e dialise durante mais duas horas.
Troque o tampão de diálise e realize a diálise durante mais duas horas ou durante a noite.
O volume total da amostra e do dialisante determina a concentração final de equilíbrio das pequenas moléculas de ambos os lados da membrana. Utilizando o volume apropriado de dialisante e realizando diversas trocas de tampão, a concentração de pequenos contaminantes na amostra pode ser reduzida para níveis aceitáveis ou negligenciáveis.
Por exemplo, quando 1 mL de amostra é dialisado contra 200 mL de dialisante, a concentração de substâncias dialisáveis indesejadas diminui 200 vezes quando o equilíbrio é atingido. Após duas trocas adicionais de tampão de 200 mL cada, o nível de contaminantes na amostra é reduzido num factor de 8 milhões (200 x 200 x 200).
Otimização do Protocolo e Variáveis Embora a diálise de uma amostra seja relativamente simples, não pode ser fornecido um procedimento de diálise universal para todas as aplicações devido às seguintes variáveis: Volume da amostra.
O tamanho das moléculas a separar.
A membrana utilizada.
A geometria da membrana, que afeta a distância de difusão.
Além disso, o ponto final da diálise é algo subjetivo e específico para cada aplicação. Portanto, o procedimento geral pode ter de ser otimizado para cada caso.
Membranas de diálise e limite de massa molecular
As membranas de diálise são produzidas e caracterizadas de acordo com o seu limite de massa molecular (MWCO). Embora as membranas com limites de massa molecular que variam entre 1 a 1.000.000 kDa estejam disponíveis comercialmente, as membranas mais utilizadas são aquelas com limites de massa molecular de cerca de 10 kDa. O limite de massa molecular de uma membrana resulta do número e do tamanho médio dos poros criados durante a produção da membrana de diálise. O limite de massa molecular refere-se geralmente à menor massa molecular média de uma molécula padrão que não conseguirá difundir-se através da membrana durante a diálise prolongada. Assim, uma membrana de diálise com um limite de corte de 10 K retém geralmente mais de 90% de uma proteína que tenha uma massa molecular de pelo menos 10 kDa.
É importante referir que o limite de massa molecular de uma membrana não é um valor claramente definido. As moléculas com massas próximas do limite da membrana difundem-se através dela mais lentamente do que as moléculas significativamente mais pequenas. Para que uma molécula se difunda rapidamente através de uma membrana, é geralmente necessário que seja pelo menos 20 a 50 vezes inferior ao limite de massa molecular dessa membrana. Assim sendo, não é viável separar as proteínas de 30 kDa das proteínas de 10 kDa por diálise através de uma membrana de diálise de 20 kDa.
As membranas de diálise de laboratório são geralmente constituídas por filme de celulose regenerada ou ésteres de celulose. Consulte a referência para uma revisão sobre as membranas de celulose e o seu fabrico.
Formatos de diálise em laboratório A diálise é geralmente realizada em bolsas de diálise com clipes ou em diversos tipos de dialisadores. A escolha do equipamento de diálise depende principalmente do tamanho da amostra e da preferência do utilizador.
Os tubos de diálise são o formato mais antigo e geralmente mais barato utilizado para a diálise em laboratório. O tubo é cortado e selado com um clipe numa extremidade e, em seguida, preenchido e selado com um clipe na outra extremidade. O tubo oferece flexibilidade, mas pode apresentar problemas de manuseamento, selagem e recuperação da amostra. Os tubos de diálise são fornecidos húmidos ou secos em rolos ou tubos telescópicos dobrados.