As topoisomerases tipo II são topoisomerases que cortam ambas as cadeias da hélice do ADN simultaneamente para solucionar os enredos e superenrolamentos do ADN. Utilizam a hidrólise do ATP, ao contrário da topoisomerase tipo I. Neste processo, estas enzimas alteram o número de ligação (ou índice de ligação) do ADN circular em ±2. As topoisomerases são enzimas ubiquas, encontradas em todos os organismos vivos.
Em animais, a topoisomerase II é um alvo da quimioterapia. Em procariotas, a girase é um alvo antibacteriano. Estas enzimas são interessantes para uma ampla variedade de efeitos.
Função
As topoisomerases tipo II aumentam ou diminuem o número de ligação de um ciclo de ADN em 2 unidades, e promovem o desenredar dos cromossomas. Por exemplo, a ADN girase, uma topoisomerase de tipo II de Escherichia coli e da maioria dos demais procariotas, introduz superenrolamentos negativos e diminui o número de ligação em 2. A girase também pode eliminar os nós do cromossoma bacteriano. Juntamente com a girase, a maioria dos procariotas também contém uma segunda topoisomerase tipo IIA, denominada topoisomerase IV. A girase e a topoisomerase IV diferenciam-se nos seus domínios C-terminais, que se crê determinarem a especificidade do substrato e a funcionalidade destas duas enzimas. A determinação das impressões da girase (footprints) indica que a girase, que forma uma impressão de 140 pares de bases e envolve o ADN, introduz superenrolamentos negativos, enquanto a topoisomerase IV, que as forma de 28 pares de bases, não envolve o ADN.
As topoisomerases tipo II eucariotas não podem introduzir superenrolamentos; apenas podem relaxá-los.
As funções das topoisomerases tipo IIB são menos conhecidas. Ao contrário das topoisomerases de tipo IIA, as de tipo IIB não podem simplificar a topologia do ADN (ver abaixo), mas partilham várias características estruturais com as topoisomerases IIA.
Simplificação da topologia
As topoisomerases tipo IIA são essenciais para a separação de cadeias filhas enredadas durante a replicação. Crê-se que esta função é realizada pela topoisomerase II em eucariotas e pela topoisomerase IV em procariotas. Falhas no momento de separar estas cadeias originam a morte da célula. As topoisomerases tipo IIA têm a capacidade especial de relaxar o ADN a um estado abaixo do equilíbrio termodinâmico, uma característica diferente da apresentada pelas topoisomerases de tipo IA, IB e IIB. Esta capacidade, conhecida como simplificação da topologia, foi identificada por Rybenkov et al. A hidrólise do ATP causa esta simplificação, mas ainda não se conhece um mecanismo molecular claro para a mesma. Foram propostos vários modelos para explicar este fenómeno, incluindo dois modelos que dependem da capacidade das topoisomerases tipo IIA de reconhecer duplexes de ADN dobrados. A bioquímica, a microscopia eletrónica e as recentes estruturas conhecidas de topoisomerases II ligadas ao ADN revelam que as topoisomerases tipo IIA se ligam aos ápices do ADN, o que apoia este modelo.
Classificação Existem duas subclasses de topoisomerase de tipo II: IIA e IIB.
As topoisomerases tipo IIA compreendem as enzimas ADN girase, topoisomerase II eucariota (topo II), e topoisomerase IV bacteriana (topo IV). Estas enzimas abrangem todos os domínios da vida e são essenciais para a função.
As topoisomerases tipo IIB são distintas do ponto de vista estrutural e bioquímico, e o membro prototípico é a topoisomerase VI (topo VI). As topoisomerases tipo IIB encontram-se em arqueas e algumas plantas superiores.
Alguns organismos, incluindo os humanos, têm duas isoformas de topoisomerase II: alfa e beta. Em cancros, a topoisomerase IIα expressa-se profusamente em células proliferativas. Em certos cancros, como os tumores da bainha de nervos periféricos, a alta expressão da sua proteína codificada está também associada a um mau prognóstico de sobrevivência do paciente.
As duas classes de topoisomerases possuem um mecanismo de passagem de cadeia semelhante e estrutura de domínios (ver abaixo), mas também têm diferenças importantes. As topoisomerases tipo IIA formam quebras de cadeia dupla com extremidades coesas que sobressaem em quatro pares de bases, enquanto as topoisomerases tipo IIB formam quebras de cadeia dupla com extremidades que sobressaem em duas bases. Além disso, as topoisomerases tipo IIA podem simplificar a topologia do ADN, enquanto as tipo IIB não.
Estrutura Tipo IIA
miniatura|Estrutura esquemática da girase, orientada invertida em comparação com outros exemplos no artigo. miniatura|upright=2|Estrutura da topoisomerase II de levedura ligada a um duplex de ADN de 34mer com dupla incisão (). O pregueamento Toprim está colorido a ciano; o ADN a alaranjado; o HTH a magenta, e a porta C a púrpura. Note-se que o ADN está dobrado ~160 graus à altura de uma isoleucina invariante (Ile833 em leveduras). As topoisomerases tipo IIA constam de vários motivos chave:
um domínio de ATPase GHKL N-terminal (na girase, Hsp90, histidina quinase e MutL),
um domínio Toprim (uma subclasse do pregueamento Rossmann), que existe em ambos os tipos de topoisomerase II, as topoisomerases de tipo IA e a primase bacteriana (DnaG),
um núcleo central de ligação ao ADN (que forma estruturalmente uma estrutura em forma de coração), e
um domínio C-terminal (CTD) variável.
As topoisomerases tipo II eucariotas são homodímeros (A2), enquanto as procariotas são heterodímeros (A2B2). Os procariotas têm um domínio ATPase e o pregueamento Toprim num polipéptido (), enquanto o núcleo de clivagem do ADN e o CTD estão situados no segundo polipéptido (). Na girase, o primeiro polipéptido denomina-se GyrB e o segundo polipéptido chama-se GyrA. Na topo IV, o primeiro polipéptido denomina-se ParE e o segundo ParC. Ambas as assinaturas de Pfam encontram-se na topoisomerase eucariota de uma só cadeia.
As estruturas do domínio ATPase N-terminal da girase e a região ATPase da topoisomerase II de leveduras; foram resolvidas em complexo com AMPPNP (um análogo do ATP), mostrando que dois domínios de ATPase se dimerizam para formar uma conformação fechada. Na girase, a estrutura tem um buraco substancial no meio, onde se supõe que se acomoda o segmento T (T de transporte).
Unindo o domínio ATPase ao pregueamento Toprim existe um elemento helicoidal conhecido como domínio transdutor. Pensa-se que este domínio comunica o estado nucleotídico do domínio ATPase ao resto da proteína. Modificações deste domínio afetam a atividade da topoisomerase, e o trabalho estrutural realizado pelo grupo liderado por Verdine mostra que o estado com ATP afeta a orientação do domínio transdutor.
O núcleo central da proteína contém um pregueamento Toprim e um núcleo de ligação ao ADN que contém um domínio de hélice alada (WHD), frequentemente denominado domínio CAP, já que foi identificado inicialmente como semelhante à proteína ativadora por catabolito WHD. A tirosina catalítica situa-se neste WHD. O pregueamento Toprim é um pregueamento Rossmann que contém três resíduos ácidos invariantes que se coordenam com iões magnésio implicados na clivagem e na religação do ADN. A estrutura do pregueamento Toprim e o núcleo de ligação ao ADN da topoisomerase II de leveduras foi resolvida pela primeira vez por Berger e Wang,; e o primeiro núcleo de ligação ao ADN da girase foi resolvido por Morais Cabral et al.; A estrutura resolvida por Berger revelou pistas importantes sobre a função da enzima. O núcleo de ligação ao ADN consta do WHD, o qual origina um domínio torre. Uma região superenrolada origina um domínio C-terminal que forma a principal interface do dímero para este estado cristalino (que se costuma denominar porta C). Embora a estrutura da topoisomerase II original mostre uma situação na qual os WHDs estão separados por uma grande distância, a estrutura da girase mostra uma conformação fechada, na qual os WHDs estão próximos.
O núcleo da topoisomerase II foi posteriormente resolvido em novas conformações, entre elas uma por Fass et al.; e outra por Dong et al.; A estrutura de Fass mostra que o domínio Toprim é flexível e que esta flexibilidade pode permitir que dito domínio se coordene com o WHD para formar um complexo de clivagem competente. Isto foi finalmente solucionado pela estrutura obtida por Dong et al., que foi resolvida na presença de ADN. Esta última estrutura mostrou que o domínio Toprim e o WHD formavam um complexo de clivagem muito semelhante ao das topoisomerases de tipo IA e indicava que a ligação e clivagem do ADN podiam estar desacopladas; a estrutura obtida mostrou que o ADN estava dobrado cerca de ~150 graus à altura de uma isoleucina invariante (na topoisomerase II é a I833 e na girase é a I172). Este mecanismo de dobramento recorda o da integração do fator hospedeiro (IHF) e HU, que são duas proteínas arquiteturais de bactérias. Além disso, embora as estruturas prévias do núcleo de ligação ao ADN tivessem a porta C fechada, esta estrutura capturou a porta aberta, um passo fundamental no mecanismo de duas portas (ver abaixo).
Mais recentemente, resolveram-se várias estruturas com ADN ligado numa tentativa de compreender tanto o mecanismo químico para a clivagem do ADN como as bases estruturais da inibição da topoisomerase por venenos antibacterianos. A primeira arquitetura completa da ADN girase de Escherichia coli foi resolvida por microscopia crioeletrónica a uma resolução quase atómica. O complexo da nucleoproteína foi capturado com um longo duplex de ADN e gepotidacina, um novo inibidor de topoisomerase bacteriano.
A região C-terminal das topoisomerases procariotas resolveu-se em muitas espécies. A primeira estrutura de um domínio C-terminal da girase foi resolvida por Corbett et al.; e o domínio C-terminal da topoisomerase IV foi resolvido por Corbett et al.; As estruturas formavam um novo barril beta, que dobra o ADN ao envolver o ácido nucleico ao seu redor. Propôs-se que o dobramento do ADN pela girase era um mecanismo chave na capacidade da girase de introduzir superenrolamentos negativos no ADN. Isto é consistente com dados de impressões da girase que mostram que esta tem uma impressão de 140 pares de bases. Tanto os domínios C-terminais da girase como da topoisomerase IV dobram o ADN, mas apenas a girase introduz superenrolamentos negativos.
Ao contrário da função bem conhecida do domínio C-terminal das topoisomerases procariotas, a função desta região na topoisomerase II eucariota ainda não é clara. Estudos sugeriram que esta região é regulada por fosforilação e que isto modula a atividade da topoisomerase, embora seja necessária mais investigação.
Tipo IIB miniatura|upright=2|Estrutura da topo VI () numa orientação semelhante ao exemplo de levedura. As cadeias estão coloridas de forma distinta. O domínio Toprim fica na parte de cima e o domínio de ATPase na parte inferior; cada uma forma uma porta ADN.
A organização das topoisomerases tipo IIB é semelhante à das de tipo IIA, exceto que todas as de tipo IIB procedem de dois genes e formam heterotetrámeros. Um gene, denominado topo VI-B (já que recorda a gyrB), contém o domínio de ATPase, um domínio transdutor (), e um domínio H2TH de pregueamento semelhante a Ig C-terminal (). O segundo gene, denominado topo VI-A (), contém o WHD e o domínio Toprim.
O domínio ATPase da topo VI B foi resolvido em muitos estados nucleotídicos.; Recorda estreitamente o domínio GHKL da topo II e MutL e mostra que o estado nucleotídico (ADP face a ATP) tem efeitos na orientação do domínio transdutor.
A estrutura da topo VI-A foi resolvida por Bergerat et al. mostrando que o HTH e o pregueamento Toprim têm uma nova conformação comparada com a da topo IIA.