A tripsina é um tipo de enzima que age nas proteínas que se encontram no quimo (massa de aspecto branco leitoso que corresponde ao bolo alimentar depois de no estômago se juntar com ácido clorídrico (HCl), que dilacera as fibras musculares, juntamente com pepsina e quimotripsina, onde quebra as proteínas em peptídeos mais simples) dentro do intestino delgado (no duodeno - primeira parcela do intestino delgado). thumb|300 px|Tripsina-1 tetramer, Human.
IdentificadoresNúmero EC3.4.21.4Número CAS9002-07-7 Banco de DadosBRENDA BrendaIntEnz IntEnz ExPASy NiceZyme view KEGG KEGG MetaCyc Via Metabólica Estruturas PDB RCSB PDB PDBsum MEROPS Família S1 InterPro IPR001254
Síntese É produzida pelo pâncreas numa forma inativa denominada tripsinogênio, que ao atingir o duodeno se transforma em tripsina inativa devido a enteroquinase presente no suco intestinal. A tripsina atua sobre o quimotripsinogênio e as propeptidases, transformando-os em quimotripsina e peptidases ativas. Sua molécula beta constituída por uma única cadeia de polipeptídeo, de 223 aminoácidos,HIROSE, André Luis Sakaguchi. Estudo da extração de tripsina em sistemas de duas fases aquosas numa micro coluna.. 2001. Dissertação (Mestre em Engenharia Química) - Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas. Campinas, p.152. 2001. com dois domínios semelhantes, ligados de forma assimétrica cujas interfaces estão inseridas os resíduos de aminoácidos catalíticos. Onde tem uma tríade catalítica: Serina, Histidina e Aspartato.SANTOS, Cláudio Willian Victor dos. Serino protease e inibidor de tripsina: purificação, caracterização e aplicação biotecnológica. 2020. Tese (Doutorado em Ciências) – Instituto de Química e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas. Maceió, p. 144. 2020. É uma proteína globular solúvel em água com peso molecular de 23,3 kDa, na sua estrutura existe um resíduo de aspartato (Asp 189), na base da bolsa S1, que atrai e estabiliza um resíduo de arginina ou lisina de carga positiva do substrato.SANTOS, Leidiane Almeida Estudo da interação da enzima tripsina com nanopartículas de ouro. 2020. Dissertação (Mestrado em Química) - Unidade Acadêmica Especial de Física e Química, Universidade Federal de Goiás. Catalão, p. 67. 2020.
Função e atividade enzimática A tripsina é uma enzima digestiva de proteínas presente em animais, vegetais (pouco descrita na literatura) e em micro-organismos. E sendo uma serino endopeptidase, atua dentro das cadeias polipeptídicas, tendo como função hidrolisar especificamente ligações peptídicas do lado carboxílico dos resíduos de lisina e arginina carregadas positivamente, onde em seu mecanismo catalítico, tem um resíduo de serina ativado envolvida no processo, em que realiza o ataque nucleofílico ao carbono carbonil de uma ligação peptídica suscetível. Sendo assim, esta enzima pertence a família das serino proteases (DVORAK, 2018)(MINAYA, 2012). A tripsina também é capaz de ativar o próprio tripsinogênio (não somente o enteropeptidase tem ação hidrolítica sobre o mesmo) e, de outras pré-enzimas como quimotripsinogênio, a proelastase, o calicreinogênio, a procarboxipeptidase e algumas prolipases. A tripsina também tem interações com células pancreáticas e inflamatórias, onde demonstra ter um papel fundamental na regulação da função exócrina pancreática.
Abaixo a reação da tripsina proveniente da larva de besouro da espécie Zabrotes subfasciatus sobre o substrato Z-Phe-Arg-7-amido-4-metilcoumarina (substrato AMC-ligado), gera os produtos Z-Phe-Arg e 7-amino-4-metilcoumarina (AMC), em pH ótimo 8.Braunschweig Enzyme Database, Atividade enzimática tripsina Zabrotes subfasciatus, BRENDA, 17 de outubro de 2021 Onde o AMC é um indicador fluorescente sintético, altamente utilizado como princípio de detecção para medição indireta da atividade proteolítica da enzima de interesse. Este corante é quantificado por um leitor de microplacas (fluorímetro), através da emissão de luz em um determinado comprimento de onda, quando liberado do substrato sintético. O aumento da intensidade de fluorescência em função do tempo reflete então, na velocidade de reação.
centro|miniaturadaimagem|605x605px|Z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin + H2O → Z-Phe-Arg + 7-amino-4-methylcoumarin
Os dois indicadores fluorescentes sintéticos mais utilizados são 4-metilumbeliferona (MUB), e 7-amino-4-metilcoumarina (AMC) para detecção de atividade enzimática.
Purificação Para um estudo mais aprofundado com a caracterização das atividades e propriedades de uma enzima, é necessário primeiramente a sua purificação de uma amostra biológica de interesse (célula ou tecido). A escolha da técnica a ser empregada depende do conhecimento de características físico-químicas e biológicas da proteína em questão, que podem ser: por tamanho (massa molecular), carga, hidrofobicidade, solubilidade, atividade biológica e bioespecificidade (afinidade biológica por determinados compostos). No caso:
+ Técnicas utilizadas na marcha de purificação em função das propriedades físico-químicas da enzima Tamanho - Massa - Densidade Carga elétrica Hidrofobicidade Solubilidade Afinidade biológica Centrifugação diferencial Cromatografia de troca iônica Cromatografia de interação hidrofóbica Salting-in Cromatografia de afinidade Diálise Eletroforese Salting out Gel-filtração ou cromatografia de exlusão molecular Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Normalmente muitas tripsinas são purificadas de espécies de peixes de água doce ou salgada, devido ao seu forte potencial biotecnológico pois além das aplicabilidades industriais, tripsinas provenientes das vísceras, que são consideradas subprodutos na comercialização de peixes, assumem bons níveis de reatividade em condições extremas, quando comparadas à tripsinas de outras espécies (Sus scrofa domesticus).MARCUSCHI, Marina Purificação e caracterização de uma tripsina do peixe amazônico tambaqui (Colossoma macropomum) . 2010. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Fisiologia) - Centro de Ciências Biológicas. Departamento de Bioquímica e Fisiologia, Universidade Federal de Pernambuco. Recife, p. 97. 2010. Como exemplo em alta alcalinidade e temperatura, bem como em presença de agentes surfactantes (mais estáveis) (KHANGEMBAM, 2015). Onde em muitos estudos, a purificação e a caracterização desta enzima provenientes das vísceras de peixes acabaram por ser alvos de pesquisas. Então de acordo com a literatura, como principais fontes biológicas (vísceras) utilizadas na marcha de purificação da tripsina, temos das espécies: SANTOS, Cláudio Willian Victor dos. Purificação e caracterização de tripsina a partir do ceco-pilórico do Pacamã (Lophiosilurus alexandri). 2016. Dissertação (Mestrado em Química e Biotecnologia) - Instituto de Química e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas. Maceió, p. 82. 2016.
Pseudupeneus maculatus (SOUZA et al., 2007). Lutjanus vitta (KHANTAPHANT e BENJAKUL, 2010). Sardinella aurita (KHALED et al., 2011). Diapterus rhombeus (SILVA et al., 2011). Salaria basilisca (KTARI et al., 2012).
Então de uma forma geral, usando as vísceras de peixes como material de partida para obtenção do extrato bruto/homogenato (tratamento térmico), as técnicas seguintes para obtenção de uma amostra pura de tripsina são, no caso para a espécie Boops boops:Braunschweig Enzyme Database, Purificação tripsina Boops boops, BRENDA, 17 de outubro de 2021
Precipitação em sulfato de amônia, gel filtração e cromatografia de troca iônica, onde a atividade enzimática específica foi medida (5.2 mU) com os substratos N-benzoil-DL-arginina 4-nitroanilida e éster etílico de N-alfa-benzoil-L-arginina em pH 9 à 25°C. A enzima purificada também foi verificada por SDS-PAGE, onde 1 monômero de tripsina apresentou massa molecular de 23 kDa.
E de acordo com outros estudos, também umas das técnicas utilizadas na marcha de purificação da tripsina de peixes é a cromatografia de afinidade, em coluna de benzamidina-agarose, apesar de um alto custo quando comparado à outras técnicas.
Parâmetros funcionais Efeito pH O pH é um dos fatores que influenciam e interferem na velocidade da atividade enzimática, onde o chamado pH ótimo é o pH em que a atividade enzimática é máxima. Isso ocorre pois o sítio catalítico das enzimas pode conter resíduos de aminoácidos ionizáveis, com características básicas ou ácidas essenciais para a catálise. É importante também considerar a estabilidade da enzima sob certas condições, com o pH sendo um dos principais fatores, em que a enzima pode ser inativada se o pH estiver fora da faixa considerada ideal. O pH corresponde a - log [ H+], uma expressão da concentração de íons H+. Dessa forma, o pH determina o estado de grupos funcionais como carboxilas, por exemplo, que podem estar protonados (COOH) ou desprotonados (COO-). Dessa maneira o pH pode afetar a estrutura da enzima e a sua habilidade de interagir com o substrato, que podem ser dependentes de ligações de hidrogênio e de íons H+. Logo, um íon de H+ pode tanto atrair um grupo negativo quanto repelir um grupo mais positivo. Temos assim um efeito cinético sobre a enzima, onde podemos considerar o próton como ativador ou inibidor da mesma. Então o efeito de ionização dos grupos da enzima pode alterar a ligação do substrato, ou a eficiência do complexo catalítico. Assim também observamos variação tanto na afinidade quanto na velocidade máxima da enzima. A tripsina é ativa no intestino em pH neutro (7.0) a levemente ácido, e se mantém estável em pH alcalino, sem alterar sua estrutura, continuando com suas reações através da ligação ao reagente e subsequente catálise. Em diferentes espécies, a tripsina apresenta atividade ótima entre valores 7,0 e 8,0. A tripsina de Homo sapiens apresenta pH ótimo em 7,5 assim como de outras espécies como Astacus astacus e Bos taurus (nesse último caso hidrolisando o substrato caseína). Em um quadro geral, as tripsinas de variados organismos apresentam atividade ótima na faixa de pH que varia entre 7,0 e 11,5.Braunschweig Enzyme Database, pH ótimo tripsina, BRENDA, 17 de outubro de 2021
Efeito temperatura A temperatura também é um fator que influencia no desempenho da velocidade de reação. Onde em temperaturas altas, temos um maior fornecimento de energia, com o aumento das colisões entre a enzima e o substrato. Contudo, temperaturas altíssimas também podem levar a quebra das ligações da estrutura terciária da proteína, levando a desnaturação da mesma, onde se torna disfuncional, sem poder realizar mais atividade catalíticas. Dependem de fatores como o pH e força iônica do meio e, também da presença ou ausência de ligantes. A tripsina por ser monomérica, composta estruturalmente por dois domínios, mais simples, acaba sendo mais estável a elevadas temperaturas, frente a proteínas oligoméricas. Na literatura, encontra-se valores extremos de temperatura consideráveis estáveis para a ação da tripsina de diferentes organismos. Como por exemplo, tripsinas pertencente as espécies Sepia officinalis e Colossoma macropomum (em substrato N-benzoil-DL-arginina 4-nitroanilida), se encontram estáveis à 70°C, enquanto que tripsinas provenientes da espécie Sus scrofa, são estáveis em 6°C, onde inclusive são tripsinas do javali aplicadas para a síntese de insulina humana, através da clivagem do substrato pre-Pro-Arg-insulin, com subsequente etapas de purificação. Vale ressaltar também que como descrito acima na seção de purificação, tripsinas provenientes de organismos marinhos são mais resistentes a elevadas temperaturas, quando comparadas à tripsinas de outros organismos. Onde na literatura vemos tripsinas provenientes de peixes, moluscos e crustáceos marinhos estáveis em temperaturas que variam de 60 à 70°C.Braunschweig Enzyme Database, Temperaturas estáveis tripsina, BRENDA, 17 de outubro de 2021
Cinética enzimática