Amplificarea ciclică a plierii greșite a proteinelor (PMCA, din engl. protein misfolding cyclic amplification) este o tehnică de laborator utilizată pentru amplificarea in vitro a prionilor sau a proteinei prionice pliate greșit. Metoda a fost dezvoltată inițial de Claudio Soto și colaboratorii săi și a fost descrisă pentru prima dată în 2001.

PMCA este adesea comparată conceptual cu PCR, deoarece permite amplificarea unui agent patologic prezent în cantități foarte mici, însă nu folosește acizi nucleici, ci se bazează pe proprietatea prionilor de a induce conversia PrPC în forma anormală PrPSc. În procedura clasică, perioadele de incubare sunt alternate cu etape de sonicare, care fragmentează agregatele prionice și generează noi „semințe” de conversie, crescând astfel sensibilitatea detecției.

Tehnica este folosită în cercetarea bolilor prionice și în detectarea unor cantități foarte mici de prioni în țesuturi și fluide biologice. Ea a fost aplicată în studierea și detectarea unor encefalopatii spongiforme transmisibile precum boala cașectizantă cronică (CWD), encefalopatie spongiformă bovină (BSE) și alte boli prionice ale oamenilor și animalelor.

În cazul CWD, studiile au arătat că PMCA poate detecta prioni chiar și în probe de sânge recoltate în stadii presimptomatice, ceea ce a făcut tehnica relevantă pentru dezvoltarea unor metode de diagnostic ante-mortem.

Tehnică PMCA pornește de la amestecarea unei cantități foarte mici de prioni sau PrPSc anormale cu un exces de PrPC normală, care servește drept substrat. În cursul incubării, forma patologică induce conversia unei părți a proteinei normale în agregate suplimentare de tip prionic.

Agregatele formate sunt apoi fragmentate prin sonicare, ceea ce generează noi „semințe” capabile să convertească alte molecule de PrPC. Repetarea succesivă a ciclurilor de incubare și sonicare duce la o amplificare exponențială a materialului prionic detectabil.

Automatizare Dezvoltarea versiunilor automatizate, denumite adesea serial automated PMCA (saPMCA), a crescut mult sensibilitatea și reproductibilitatea metodei. Potrivit unui review, prin mai multe runde succesive PMCA poate detecta cantități extrem de mici de PrPSc, de ordinul attogramelor sau chiar al câtorva zeci de molecule.

Material inițial În formele clasice, PMCA a folosit ca substrat omogenat cerebral normal, care furnizează atât PrPC, cât și cofactori necesari conversiei eficiente. Ulterior, au fost dezvoltate variante bazate pe , lizați celulari și sisteme cu cofactori definiți, pentru a reduce costurile și a standardiza mai bine reacția.

Studiile experimentale au arătat că polianioni și fosfolipide pot acționa ca factori favorizanți ai conversiei prionice în unele sisteme PMCA, inclusiv în reacții bazate pe proteină recombinantă.

Limitări și variații Sensibilitatea PMCA este foarte mare, dar metoda poate fi afectată de contaminare încrucișată și de apariția conversiei spontane în anumite condiții experimentale, ceea ce impune controale stricte și standardizare atentă. Din acest motiv, descrierile despre generarea de novo a materialului prionic în absența unui inocul inițial sunt prezentate în literatura de specialitate ca rezultate experimentale particulare, nu ca mod obișnuit de utilizare a metodei.

Utilizări

Proteine prionice PMCA este utilizată pe scară largă pentru studierea biologiei prionilor și pentru detectarea ultrasensibilă a PrPSc. Tehnica a fost folosită pentru investigarea mecanismelor de replicare prionică, a fenomenelor de barieră de specie și de tulpină prionică, precum și pentru evaluarea rolului cofactorilor moleculari în conversia proteinei prionice normale în forma patologică.

PMCA a fost aplicată și în detectarea prionilor în țesuturi și fluide biologice, inclusiv sânge, urină, mucoasă olfactivă și alte probe periferice, uneori chiar în stadii presimptomatice ale bolii. Aceste aplicații au făcut din PMCA un instrument important pentru dezvoltarea unor teste de diagnostic mai sensibile decât metodele clasice bazate pe western blot.

În cercetarea fundamentală, PMCA a contribuit la demonstrarea faptului că prionii infecțioși pot fi generați in vitro din componente foarte reduse, inclusiv proteine recombinante și cofactori precum polianioni și lipide. Aceste rezultate au fost considerate o susținere importantă pentru ipoteza prionică.

Alfa-sinucleină Principiul PMCA a fost adaptat și pentru alte proteine capabile de agregare patologică, în special pentru alfa-sinucleină. Într-un studiu publisher în Nature în 2020, un test de tip α-syn-PMCA a reușit să distingă probele de lichid cefalorahidian provenite de la pacienți cu boala Parkinson de cele provenite de la pacienți cu , cu o sensibilitate globală raportată de 95,4%. Autorii au arătat că agregatele de alfa-sinucleină amplificate prin această metodă păstrează semnături biochimice distincte, ceea ce poate ajuta la diferențierea unor clinic asemănătoare.

Sensibilitate PMCA este considerată una dintre cele mai sensibile metode pentru detectarea prionilor sau a PrPSc. Review-urile recente arată că variantele optimizate ale metodei pot atinge limite de detecție de ordinul attogramelor de PrPSc, adică niveluri corespunzătoare unui număr extrem de mic de particule sau agregate prionice.

Această sensibilitate foarte mare a făcut posibilă detectarea PrPSc în probe biologice în care metodele clasice, precum western blot, sunt adesea insuficient de sensibile. În studiile experimentale, serial PMCA și variantele sale automatizate au permis amplificarea unor diluții extrem de mari de material prionic până la nivel detectabil.

Sensibilitatea PMCA a deschis și posibilitatea detectării prionilor în sânge, urină și alte probe periferice, inclusiv în stadii presimptomatice ale unor boli prionice. Review-urile despre aplicațiile clinice și experimentale ale metodei menționează detecția prionilor în sângele animalelor sau oamenilor infectați, inclusiv înainte de debutul clinic, precum și în urina unor pacienți cu boala Creutzfeldt-Jakob.

Prin această capacitate de amplificare, PMCA este adesea comparată conceptual cu PCR, deși procesul implică proteine pliate greșit, nu acizi nucleici.

Dezvoltare PMCA a fost dezvoltată la începutul anilor 2000 de Claudio Soto și colaboratorii săi ca o metodă in vitro de a reproduce, într-o formă accelerată, etape esențiale ale replicării prionilor. Metoda a fost concepută pentru a depăși limitările experimentale ale studiului prionilor, oferind un sistem fără celule în care conversia PrPC în forma patologică putea fi urmărită și amplificată în laborator.

PMCA este adesea comparată conceptual cu PCR, deoarece ambele metode se bazează pe amplificarea ciclică a unui semnal biologic pornind de la cantități inițiale foarte mici. În cazul PMCA, „șablonul” este reprezentat de agregatele sau „semințele” prionice, care induc conversia substratului proteic normal și sunt apoi multiplicate prin cicluri repetate de incubare și sonicare.

Review-urile moderne descriu PMCA ca una dintre primele și cele mai influente tehnici de amplificare a proteinelor pliate greșit, din care au derivat ulterior și alte teste de tip seed amplification assay, precum RT-QuIC.

Note

Vezi și

Western blotting

Categorie:Biologie moleculară Categorie:Tehnici de laborator