Масово-паралельне секвенування (), також відоме як секвенування наступного покоління () — це група високотехнологічних методів визначення нуклеотидної послідовності ДНК та РНК, що дозволяють одночасно проводити мільйони паралельних реакцій зчитування. Ця технологія забезпечила експоненційне зростання пропускної здатності приладів при одночасному зниженні вартості аналізу на кілька порядків порівняно з класичними методами.
Історія розвитку Протягом майже трьох десятиліть у молекулярній біології домінував метод секвенування за Сенгером (перше покоління), розроблений у 1977 році. Він базувався на капілярному електрофорезі та термінації ланцюга дидезоксинуклеотидами, що дозволяло зчитувати лише один фрагмент ДНК за раз. Проєкт «Геном людини», завершений у 2003 році за допомогою цього методу, тривав 13 років і коштував близько 2,7 мільярда доларів США.
Ера NGS розпочалася у 2005 році з виходом комерційної системи GS 20 від компанії 454 Life Sciences, яка використовувала принцип піросеквенування. Це ознаменувало перехід до масового паралелізму: замість розділення фрагментів у гелі, нові прилади фіксували сигнали безпосередньо у процесі синтезу (). Подальший розвиток технологій протягом наступного десятиліття призвів до появи різноманітних комерційних платформ і радикального підвищення ефективності аналізу.
Етапи технологічного процесу Загальний робочий цикл NGS другого покоління базується на різних фізико-хімічних принципах, але зазвичай включає три основні етапи:
Підготовка бібліотек (): Досліджувана ДНК фрагментується на ділянки (зазвичай 150–500 пар основ). До кінців фрагментів приєднуються синтетичні адаптери, які дозволяють фіксувати ДНК на підкладці та додавати унікальні бар-коди для одночасного аналізу зразків від багатьох пацієнтів (Мультиплексування). Клональна ампліфікація (): Для посилення сигналу кожна поодинока молекула бібліотеки розмножується в ізольованому локусі. Основні підходи: Місткова ампліфікація (): використовується платформою Illumina; фрагменти згинаються в «мости» на поверхні проточної комірки, утворюючи кластери ідентичних молекул. Емульсійна ПЛР (): фрагменти ампліфікулярно розмножуються всередині мікрокрапель суміші води та оливи на поверхні мікросфер (використовується в Ion Torrent та Roche 454). ДНК-нанокулі (): метод реплікації «ротаційного кола» (RCA), що застосовується компаніями MGI/BGI. Власне секвенування та детекція: Прилади фіксують включення кожного нового нуклеотиду. Наприклад, у системах Illumina це відбувається через оптичну детекцію флуоресценції, а в системі Ion Torrent — напівпровідниковим шляхом через реєстрацію зміни pH внаслідок вивільнення іонів водню H+.
Третє покоління секвенування Сучасні технології третього покоління дозволяють аналізувати поодинокі молекули () в реальному часі без попередньої ампліфікації, що усуває помилки, пов'язані з ПЛР.
SMRT-технологія (PacBio): використовує хвилеводи нульової моди (ZMW), де ДНК-полімераза синтезує ланцюг у реальному часі, дозволяючи фіксувати флуоресцентний сигнал від поодиноких молекул та отримувати наддовгі читання понад 50 000–100 000 пар основ. Нанопорове секвенування (Oxford Nanopore): молекула ДНК протягується крізь білкову пору, вбудовану в резистивну мембрану, викликаючи специфічні зміни електричного струму для кожної основи.
Застосування NGS радикально змінило біомедичні дослідження та інтегрувалося в клінічну практику як рутинний діагностичний інструмент: Клінічна діагностика: використання таргетних панелей генів (зокрема, в онкології чи кардіології), повноекзомне (WES) та повногеномне секвенування (WGS) для виявлення причин рідкісних спадкових хвороб. Онкологія: виявлення соматичних мутацій у пухлинах для підбору персоналізованої (таргетної) терапії. Пренатальний скринінг (NIPT): аналіз вільної фетальної ДНК у крові вагітної для виявлення хромосомних аномалій плода. Метагеноміка: дослідження мікробних спільнот без необхідності їх культивування.
Біоінформатика Великі масиви даних, отримані при NGS, потребують складного комп'ютерного опрацювання. Основні етапи включають оцінку якості зчитування (бал Phred або Q), вирівнювання на референсний геном людини та пошук генетичних варіантів () для ідентифікації патогенних мутацій.
Див. також
Секвенування ДНК
Секвенатор ДНК Повне секвенування геному Секвенування ракового геному Проєкт геному людини
Примітки
Посилання Основи секвенування нового покоління (NGS) — Анна Яручик, експерт Бюро ВООЗ в Україні (на Платформі Центру громадського здоров'я МОЗ України). Масово–паралельне секвенування (NGS): еволюція методів та технологічний процес — Степан Бегларян (огляд від лікаря). Еволюція методів секвенування ДНК та перспективи їх використання в судовій молекулярно-генетичній експертизі — Базилюк Ж. (2020). Молодий вчений, 11 (87), 123-127. https://doi.org/10.32839/2304-5809/2020-11-87-27 Послідовність наступного покоління — матеріали української бібліотеки LibreTexts.