W 1515 kapituła katedralna w Sewilli przyjęła statut „limpieza de sangre” ("czystości krwi"), wykluczający osoby żydowskiego pochodzenia z członkostwa w kapitule.
W 1491 utworzony został osobny trybunał dla diecezji Kadyksu z siedzibą w Jerez de la Frontera. Jednakże po około 12 latach diecezja Kadyksu powróciła pod jurysdykcję inkwizytorów Sewilli.
Działalność inkwizycji sewilskiej w pierwszej połowie XVI wieku pozostaje słabo udokumentowana. Żydowscy konwertyci byli głównym celem inkwizycji co najmniej do początku trzeciej dekady tego stulecia, natomiast później w coraz większym stopniu zaczęła zwracać się w kierunku morysków (arabskich konwertytów podejrzewanych o potajemne wyznawanie islamu) i chrześcijan pochodzenia kastylijskiego (tzw. „starych chrześcijan”). W latach 50. XVI wieku w Sewilli wykryto grupę hiszpańskich zwolenników reformacji. Zostali oni skazani podczas kilku autos da fe między 1559 a 1562 (łącznie 55 spalonych). Domniemani sympatycy luteranizmu byli głównym obiektem zainteresowań inkwizytorów Sewilli jeszcze przez kolejną dekadę, ale byli to już niemal wyłącznie cudzoziemcy przebywający w Hiszpanii.