jeżeli nie znakowanym nukleotydem użytym do reakcji jest dATP. Sondy znakowane w ten sposób są odpowiednie do doświadczeń wymagających optymalnej czułości, takich jak hybrydyzacje typu i . Metody 1. i 2. umożliwiają nieradioaktywne znakowanie konwencjonalnie zsyntetyzowanych oligonukleotydów. Znakowanie oligonukleotydów na 5′-końcu – wykonywane jest przy użyciu estrów NHS-digoksygeniny. Oligonukleotydy są znakowane przez dodanie DIG na 5′-końcu w dwuetapowym procesie. Pierwszym etapem jest synteza oligonukleotydu z resztą aminową na 5′-końcu. Po oczyszczeniu syntetycznego nukleotydu następuje drugi etap – tworzenie wiązań kowalencyjnych między estrem NHS-digoksygeniny i 5′-końcową resztą aminową oligonukleotydu. Sondy są specyficzne – mają czułość porównywalną z sondami znakowanymi na 3′-końcu i są odpowiednie do przeszukiwania bibliotek genomowych i . Inną istotną cechą tak znakowanych sond jest wolny 3′-koniec, który może stać się starterem w reakcji syntezy DNA metodą PCR. Ilość wyznakowanych sond jest 1000 razy większa, niż przy znakowaniu na 3′-końcu. Mogą być one wykrywane i oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa z użyciem przeciwciał anty-digoksygeninowych.