Ze względu na to, że nurty reformacji zostały odrzucone przez władze Uniwersytetu Krakowskiego, druki innowiercze podlegały cenzurze, a profesorowie – zwolennicy reformacji opuścili miasto, akademia straciła studentów zagranicznych, a liczba studentów polskich i litewskich zmalała. Bogatsi coraz częściej wybierali studia za granicą, w Niemczech, Bolonii czy Padwie. W Krakowie studiowała młodzież uboższa, oddająca się rabusiostwu, bójkom krwawym, napadom rozbójniczym po okolicy, dzikości i barbarzyństwu.
Król Zygmunt I Stary dla poparcia krajowej Almae Matris, zakazał w 1534 roku specjalnym edyktem, cofniętym zresztą już w kilka lat później, wyjazdów na uniwersytety zagraniczne, a w 1544 roku nadał przywilej szlachectwa zasłużonym dwudziestoletnią pracą nauczycielską profesorom Uniwersytetu KrakowskiegoCzesław Lechicki, Mecenat Zygmunta III i życie umysłowe na jego dworze, Warszawa 1932, s. 5..
Wprawdzie pod koniec XVI wieku studiowały tu jeszcze takie znakomitości jak Jan Kochanowski, Andrzej Frycz Modrzewski, Marcin Kromer czy Mikołaj Rey, ale upadek uniwersytetu się pogłębiał.