W latach 1555–1592, gdy właścicielami miasta byli protestanccy Górkowie, Andrzej Górka prawdopodobnie przejął od katolików kościół i przekształcił go na zbór kalwiński, jednak mała liczba protestantów spowodowała, że Górkowie przekazali go wyznawcom prawosławia. Jednocześnie Andrzej i Stanisław Górkowie przekazali fundusze na przebudowę świątyni. Historyk sztuki Piotr Krasny wskazuje szereg przesłanek sugerujących szesnastowieczny rodowód zachowanego do dziś obiektu. Z 1540 pochodzą żelazne drzwi w ścianie prezbiterium, opatrzone inicjałami Andrzeja Górki, co być może wskazywało na niego jako fundatora obiektu. Również ogólny wygląd świątyni w pierwszym okresie jej istnienia, ustalony dzięki badaniom archeologicznym w latach 80. i 90. XX wieku, zbliżony jest do wyglądu szesnastowiecznych cerkwi prawosławnych Wołynia.
Świątynia prawosławna najprawdopodobniej funkcjonowała w Szczebrzeszynie w połowie XIV w. Z tego okresu pochodzi pierwsza pisemna wzmianka o miejscowości, która opisuje ją jako oppidum Ruthenicale. Pierwsza bezpośrednia informacja o prawosławnej parafii datowana jest jednak dopiero na rok 1588, mówi przy tym o cerkwi istniejącej już od dawna.