Zasada działania Podstawą działania mikromacierzy jest, tak jak w tradycyjnej hybrydyzacji Southerna, komplementarność kwasów nukleinowych. Mikromacierz zawiera sekwencje komplementarne do badanych sekwencji. Próbkę kwasu nukleinowego wyznakowuje się (jednym lub dwoma znacznikami fluorescencyjnymi) i hybrydyzuje z mikromacierzą. Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji. Obraz sczytuje się ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu). Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości kwasu nukleinowego o danej sekwencji w próbce.
Intensywność sygnału dla pojedynczej sondy zależy również od siły wiązania kwasu nukleinowego z sondą, charakterystycznej dla danej sekwencji sondy. W związku z tym ilościowo można porównywać jedynie sygnał dla tej samej sondy w różnych próbkach, natomiast porównywanie sygnału dla dwóch różnych sond jest nieuprawnione.