Największy sukces odnieśli lotnicy angielscy latający na samolotach Defiant Mk I podczas osłony ewakuacji wojsk alianckich z Dunkierki, kiedy to zestrzelili 65 niemieckich samolotów bombowych. W czerwcu i lipcu 1940 roku samoloty Defiant znajdowały się na wyposażeniu 141 i 264 dywizjonu myśliwskiego RAF. Wzięły one udział w bitwie o Anglię, ale na skutek dużych strat zostały wycofane z walki, niemieccy piloci bowiem zorientowali się, że należy je atakować z przodu.
Od sierpnia 1940 roku zaczęto je stosować wyłącznie w charakterze myśliwców nocnych, naprowadzanych przez radio na cel, a potem wyposażono je w aparaturę radarową. Od połowy 1942 roku używano ich wyłącznie do szkolenia, holowania celów powietrznych oraz w ratownictwie morskim. Samoloty te znajdowały się na wyposażeniu RAF do dnia 27 lutego 1947 roku, kiedy zostały wykonany ostatni lot na tym samolocie.
Użycie w lotnictwie polskim thumb|left|Defiant Mk. I EW-D z 307 Dywizjonu, Muzeum RAF w Hendon W lotnictwie polskim samoloty Boulton Paul Defiant Mk I zostały wprowadzone do 307 Nocnego Dywizjonu Myśliwskiego „Lwowskich Puchaczy”, który został sformowany 5 września 1940 roku.