Jednak najsłynniejszym epizodem z jego udziałem był długotrwały spór z humanistą i hebraistą Janem Reuchlinem, który odbił się szerokim echem w niemieckim środowisku naukowym i akademickim. Konflikt rozpoczął się w 1509 od propozycji żydowskiego konwertyty Jana Pfefferkorna, by skonfiskować żydom wszystkie ich księgi zawierające stwierdzenia obraźliwe dla wiary chrześcijańskiej. Cesarz Maksymilian I Habsburg początkowo przychylił się do tego wniosku, jednak wobec skarg żydów zawiesił ogłoszony już dekret o konfiskacie i zwrócił się do kilku niemieckich uczonych o opinie. Wydział teologiczny uniwersytetu kolońskiego pozytywnie zaopiniował propozycję Pfefferkorna, natomiast Reuchlin, który był uznanym autorytetem w dziedzinie hebraistyki, wydał opinię sprzeciwiającą się konfiskacie żydowskich ksiąg i opublikował w 1511 dzieło zatytułowane Augenspiegel, będące apologią literatury hebrajskiej. W odpowiedzi na tę publikację Jakob van Hoogstraten, wykorzystując swoje uprawnienia inkwizytorskie, we wrześniu 1513 wszczął postępowanie przeciwko Reuchlinowi, zarzucając mu faworyzowanie judaizmu. Reuchlin skorzystał jednak z możliwości apelacji do Stolicy Apostolskiej i w rezultacie papież Leon X zarządził przekazanie sprawy do rozpoznania biskupowi Spiry Jerzemu Wittelsbachowi.