thumb|Schéma de fonctionnement optogénétique à partir de la stimulation via Channelrhodopsines (en bleu) Les channelrhodopsines sont une sous-famille de protéines rétinylidènes (rhodopsines) qui fonctionnent comme des canaux ioniques commandés par la lumière.
Elles servent de photorécepteurs sensoriels chez les algues vertes unicellulaires, contrôlant la phototaxie, c'est-à-dire le mouvement en réponse à la lumière.
Exprimées dans les cellules d'autres organismes, elles permettent à la lumière de contrôler l'excitabilité électrique, l'acidité intracellulaire, l'influx de calcium et d'autres processus cellulaires (voir optogénétique).
La channelrhodopsine-1 (ChR1) et la channelrhodopsine-2 (ChR2) de l'organisme modèle Chlamydomonas reinhardtii sont les premières channelrhodopsines découvertes.
Des variantes sensibles à différentes couleurs de lumière ou sélectives pour des ions spécifiques (ACR, KCR) ont été clonées à partir d'autres espèces d'algues et de protistes.
Historique La phototaxie et la photo-orientation des microalgues ont été étudiées pendant plus de cent ans dans de nombreux laboratoires à travers le monde.
En 1980, Ken Foster développe la première théorie complète sur la fonctionnalité des yeux des algues. À cette époque, il analyse également les spectres d'action déjà publiés et complète la recherche sur les cellules aveugles avec des analogues rétiniens, ce qui confirme la conclusion que le photorécepteur des réponses de motilité, chez les chlorophycées, est bien la rhodopsine.
Les photocourants des chlorophycées Heamatococcus pluvialis et Chlamydomonas reinhardtii ont été étudiés pendant de nombreuses années par les groupes d'Oleg Sineshchekov et de Peter Hegemann. Sur la base de la spectroscopie d'action et d'enregistrements simultanés de photocourants et de battements flagellaires, il a été déterminé que les courants des photorécepteurs et les mouvements flagellaires qui s'ensuivent sont médiés par la rhodopsine et contrôlent la phototaxie et les réponses photophobes. L'augmentation extrêmement rapide du courant du photorécepteur après un bref flash lumineux a permis de conclure que la rhodopsine et le canal sont intimement liés dans un complexe protéique, voire dans une seule protéine.
Le nom «channelrhodopsine» est inventé à partir du terme anglais pour «canal» (channel, lui-même issu de l'ancien français «chenal») pour mettre en évidence cette propriété inhabituelle. Les séquences nucléotidiques des rhodopsines désormais appelées channelrhodopsines ChR1 et ChR2 ont finalement été découvertes dans un projet de séquençage EST à grande échelle chez C. reinhardtii.
La soumission indépendante des mêmes séquences à GenBank par trois groupes de recherche a généré une confusion quant à leur dénomination : les noms cop-3 et cop-4 ont été utilisés pour la soumission initiale par le groupe de HegemannKateriya, S. Fuhrmann, M. Hegemann, P.: Direct Submission: Chlamydomonas reinhardtii retinal binding protein (cop4) gene; GenBank accession number AF461397 (2002) ; csoA et csoB par le groupe de Spudich (2002) ; et acop-1 et acop-2 par le groupe de Takahashi (2003). Les deux séquences se sont avérées fonctionner comme des canaux cationiques activés par la lumière à un seul composant dans les ovocytes de Xenopus et les cellules rénales humaines (HEK).
Leurs rôles dans la génération de courants photorécepteurs dans les cellules algales ont été caractérisés par Oleg Sineshchekov, Kwang-Hwan Jung et John Spudich d'une part, et Peter Berthold et Peter Hegemann d'autre part.
Structure vignette|Structure cristalline de la channelrhodopsine. APB 3ug9 Structurellement, les Channelrhodopsines sont des protéines de rétinylidène. Ce sont des protéines à sept transmembranes comme la rhodopsine, et elles contiennent le chromophore tout- trans-rétinal isomérisable à la lumière (un dérivé aldéhydique de la vitamine A).
Le chromophore rétinien est lié de manière covalente au reste de la protéine par une base de Schiff protonée. Alors que la plupart des protéines 7-transmembranaires sont des récepteurs couplés aux protéines G qui ouvrent indirectement d'autres canaux ioniques via des seconds messagers (c'est-à-dire qu'elles sont métabotropes), les channelrhodopsines forment directement des canaux ioniques (elles sont ionotropes). Cela rend la dépolarisation cellulaire extrêmement rapide, robuste et utile pour les applications de bio-ingénierie et de neurosciences, y compris la photostimulation.
Fonction droite|cadre| Schéma de construction d'une fusion ChR2-RFP Le ChR2 «naturel» absorbe la lumière bleue à un spectre d'absorption et d'action maximum de 480 nm. Lorsque le complexe trans-rétinien absorbe un photon, il induit un changement conformationnel trans à 13-cis-rétinien. Ce changement en introduit un autre dans la protéine transmembranaire, ouvrant le pore à au moins 6 Å.
En quelques millisecondes, la rétine se détend et revient à la forme tout-trans, fermant le pore et arrêtant le flux d'ions. La plupart des channelrhodopsines naturelles sont des canaux cationiques non spécifiques (CCR), conducteurs des ions H +, Na +, K + et Ca 2+ .
Les channelrhodopsines conductrices d'anions (ACR) récemment découvertes et les channelrhodopsines sélectives au potassium (HcKCR1, HcKCR2) ont été analysées structurellement pour comprendre leur sélectivité ionique. Les ACR et les KCR ont été utilisés pour inhiber l'activité neuronale.
Outil moléculaire En 2005, trois groupes de recherche ont séquentiellement prouvé que ChR2 pouvait servir d'outil de contrôle à distance optique génétiquement ciblé (optogénétique) des neurones, des circuits neuronaux et du comportement.
Dans un premier temps, le laboratoire de Karl Deisseroth a démontré que ChR2 pouvait être déployé pour contrôler les neurones de mammifères in vitro, atteignant une précision temporelle de l'ordre de la milliseconde (à la fois en termes de délai de pointe et en termes de gigue temporelle). Parce que toutes les opsines ont besoin de rétinal comme cofacteur de détection de la lumière et qu'il n'était pas clair si les cellules nerveuses centrales des mammifères contiendraient des niveaux de rétinal suffisants, mais c'est le cas. Il a également montré, malgré la faible conductance monocanal, une puissance suffisante pour conduire les neurones de mammifères au-dessus du seuil du potentiel d'action. À partir de là, la channelrhodopsine est devenue le premier outil optogénétique, par lequel l'activité neuronale pourrait être contrôlée avec la précision temporelle à laquelle les neurones fonctionnent (millisecondes).
Une deuxième étude a été publiée plus tard confirmant la capacité de ChR2 à contrôler l'activité neuronale de vertébrés, à ce moment dans la moelle épinière du poussin. Cette étude était la première dans laquelle ChR2 était exprimé aux côtés d'un «silenceur optique, la rhodopsine de vertébré -4 dans ce cas, démontrant pour la première fois que les cellules excitables pouvaient être activées et réduites au silence à l'aide de ces deux outils simultanément, illuminant le tissu à différentes longueurs d'onde.
Il a été démontré que ChR2, s'il est exprimé dans des neurones ou des cellules musculaires spécifiques, peut évoquer des comportements prévisibles, c'est-à-dire peut contrôler le système nerveux d'un animal en bonne santé, dans ce cas le ver nématode C. elegans. C'était la première fois que ChR2 utilisait ChR2 pour diriger le comportement d'un animal dans une expérience optogénétique, rendant ce type de cellule spécifiée soumis à une «télécommande optique».
Bien que les deux aspects aient été illustrés plus tôt cette année-là par le groupe de Gero Miesenböck, utilisant le canal ionique – indirectement – photosensible P2X2, ce sont désormais les opsines microbiennes comme la channelrhodopsine qui dominent le domaine du contrôle à distance des cellules excitables, en raison de la puissance, de la vitesse, de la «ciblabilité», de la facilité d'utilisation et de la précision temporelle de l'activation optique directe, ne nécessitant aucun composé chimique externe tel que des ligands.
Pour surmonter ses principaux inconvénients – faible conductance monocanal (surtout en régime permanent), limitation à une longueur d'onde d'excitation optimale (~ 470 nm, bleu) ainsi qu'un temps de récupération relativement long, ne permettant pas le déclenchement contrôlé des neurones au-dessus 20–40 Hz — ChR2 a été optimisé par génie génétique.
Une mutation ponctuelle H134R (échange de l'amino-acide histidine en position 134 de la protéine native contre une arginine) entraîne une augmentation de la conductance à l'état d'équilibre, comme décrit dans un article de 2005 qui établit également ChR2 comme un outil optogénétique chez C. elegans. En 2009, le laboratoire de Roger Tsien optimise ChR2 et réussi une nouvelle augmentation de la conductance à l'état d'équilibre, tout en réduisant considérablement la désensibilisation en créant des chimères de ChR1 et ChR2 et en mutant des acides aminés spécifiques, produisant ChEF et ChIEF..
En 2010, les groupes de Hegemann et Deisseroth introduisent la mutation E123T dans le ChR2 natif, produisant ChETA, qui a une cinétique «on» et «off» plus rapide, permettant le contrôle des potentiels d'action individuels à des fréquences allant jusqu'à 200 Hz (dans les types cellulaires appropriés).
Les groupes de Hegemann et Deisseroth ont également découvert que l'introduction de la mutation ponctuelle C128S fait, du dérivé ChR2 résultant, un outil à fonction échelon : une fois «allumé» par la lumière bleue, ChR2 (C128S) reste «ouvert» jusqu'à ce qu'il soit éteint par une lumière jaune – modification qui détériore la précision temporelle, mais augmente la sensibilité à la lumière de deux ordres de grandeur. Ils ont également découvert et caractérisé VChR1 dans l'algue multicellulaire Volvox carteri. VChR1 ne produit alors que de minuscules photocourants, mais avec un spectre d'absorption décalé vers le rouge par rapport à ChR2.
En utilisant des parties de la séquence ChR1, l'amplitude du photocourant a ensuite été améliorée pour permettre l'excitation de deux populations neuronales à deux longueurs d'onde distinctes..
Le groupe de Deisseroth est pionnier de nombreuses applications chez les animaux vivants, tel chez des rongeurs in vivo. Ce groupe développe aussi l'induction optogénétique de l'apprentissage chez les rongeurs, le traitement expérimental de la maladie de Parkinson chez les rats, et sa combinaison avec l'IRMf (opto-IRMf).
D'autres laboratoires ont travaillé sur la combinaison de la stimulation de ChR2 avec l'imagerie calcique (par FRET) pour des expériences tout optique, la cartographie des circuits neuronaux à longue portée. et locaux, l'expression de ChR2 à partir d'un locus transgénique - directement ou dans le paradigme conditionnel Cre-lox – ainsi que l'excitation à deux photons de ChR2, permettant l'activation de cellules individuelles.
En , le «Prix du cerveau» (Grete Lundbeck European Brain Research Prize) a été décerné conjointement à Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck et Nagel pour «leur invention et le raffinement de l'optogénétique».
La même année, Hegemann et Nagel reçoivent le prix Louis-Jeantet de médecine pour «la découverte de la channelrhodopsine».
En 2015, Boyden et Deisseroth ont reçu le prix Breakthrough en sciences de la vie et en 2020, Miesenböck, Hegemann et Nagel reçoivent le prix Shaw en sciences de la vie et médecine pour le développement de l'optogénétique.
Channelrhodopsines-outils Les channelrhodopsines sont des outils clés en optogénétique.
L'extrémité C-terminale de la Channelrhodopsine-2 s'étend dans l'espace intracellulaire et peut être remplacée par des protéines fluorescentes sans affecter la fonction du canal.