Hibridación in situ fluorescente

miniatura|Visualización de múltiples ARNs en células usando ensaios de FISH ViewRNA. dereita|miniatura|Unha célula en metafase positiva para o rearranxo xenético bcr/abl (asociado coa leucemia mielóxena crónica) vista usando FISH. Os cromosomas poden verse en azul. O cromosoma que está etiquetado con puntos verdes e vermellos (parte superior esquerda) é no que se presenta dito rearranxo. miniatura|FISH metafásico en humanos. En amarelo, o cromosoma 2. miniatura|FISH interfásico en rato. A hibridación in situ fluorescente (FISH, do inglés Fluorescence in situ hybridization)Tamén se pode ver traducida en textos científicos como "hibridación fluorescente in situ" ou "hibridación in situ con fluorescencia", entre outras posibilidades (ver Google Académico). é unha técnica citoxenética desenvolvida por investigadores médicos a comezos da década de 1980Langer-Safer, P. R.; Levine, M.; Ward, D. C. (1982). "Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes". Proceedings of the National Academy of Sciences 79 (14): 4381. Bibcode:1982PNAS...79.4381L. doi:10.1073/pnas.79.14.4381. PMC 346675. PMID 6812046. que se utiliza para detectar e localizar a presenza ou ausencia de secuencias de ADN específicas nos cromosomas. A FISH usa sondas fluorescentes que se unen só a aquelas partes do cromosoma coas cales teñen un alto grao de complementariedade de secuencia. Pode utilizarse a microscopia de fluorescencia para atopar a sonda fluorescente unida aos cromosomas. A FISH úsase con frecuencia para atopar características específicas nun ADN para usala en consellos xenéticos, medicina e identificación de especies. A FISH pode tamén utilizarse para detectar e localizar dianas de ARN específicas (ARNm, ARN non codificante longo e microARN) en células, células tumorais circulantes e mostras de tecidos. Neste contexto, pode axudar a definir os patróns espazo-temporais de expresión xénica nas células e tecidos.

Protocolo básico O primeiro paso da técnica consiste na desnaturalización do ADN para separar a dobre hélice. Á mostra desnaturalizada se lle engade entón a sonda de interese (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primeiro, as sondas hibridan nas rexións específicas para as que foron deseñadas. Despois, tínguense os núcleos cunha cor de contraste inespecífica (xeralmente DAPI). As sondas de ADN poden marcarse con moléculas fluorescentes denominadas fluoróforos (método directo) ou non fluorescentes que se detectan con anticorpos fluorescentes (método indirecto). Por último, visualízase a mostra preparada baixo un microscopio de fluorescencia.

Sondas de ARN e ADN miniatura|Detección con ViewRNA dos ARNm de miR-133 (verde) e mioxenina (vermello) en células en diferenciación C2C12. Poden deseñarse sondas de ARN para calquera xene ou calquera secuencia dentro dun xene para visualizar o ARNm,Anthony, S. J.; St. Leger, J. A.; Pugliares, K.; Ip, H. S.; Chan, J. M.; Carpenter, Z. W.; Navarrete-Macias, I.; Sanchez-Leon, M.; Saliki, J. T.; Pedersen, J.; Karesh, W.; Daszak, P.; Rabadan, R.; Rowles, T.; Lipkin, W. I. (2012). "Emergence of Fatal Avian Influenza in New England Harbor Seals". MBio 3 (4): e00166–e00112. doi:10.1128/mBio.00166-12. PMC 3419516. PMID 22851656.Everitt, A. R.; Clare, S.; Pertel, T.; John, S. P.; Wash, R. S.; Smith, S. E.; Chin, C. R.; Feeley, E. M.; Sims, J. S.; Adams, D. J.; Wise, H. M.; Kane, L.; Goulding, D.; Digard, P.; Anttila, V.; Baillie, J. K.; Walsh, T. S.; Hume, D. A.; Palotie, A.; Xue, Y.; Colonna, V.; Tyler-Smith, C.; Dunning, J.; Gordon, S. B.; Everingham, K.; Dawson, H.; Hope, D.; Ramsay, P.; Walsh (Local Lead Investigator), T. S. et al. (2012). "IFITM3 restricts the morbidity and mortality associated with influenza". Nature 484 (7395): 519. Bibcode:2012Natur.484..519. doi:10.1038/nature10921. PMID 22446628.Louzada, S.; Adega, F.; Chaves, R. (2012). "Defining the sister rat mammary tumor cell lines HH-16 cl.2/1 and HH-16.cl.4 as an in vitro cell model for Erbb2". PLoS ONE 7 (1): e29923. Bibcode:2012PLoSO...729923L. doi:10.1371/journal.pone.0029923. PMC 3254647. PMID 22253826. o ARN non codificante longo (ARNncl)Ting, D. T.; Lipson, D.; Paul, S.; Brannigan, B. W.; Akhavanfard, S.; Coffman, E. J.; Contino, G.; Deshpande, V.; Iafrate, A. J.; Letovsky, S.; Rivera, M. N.; Bardeesy, N.; Maheswaran, S.; Haber, D. A. (2011). "Aberrant Overexpression of Satellite Repeats in Pancreatic and Other Epithelial Cancers". Science 331 (6017): 593. Bibcode:2011Sci...331..593T. doi:10.1126/science.1200801. PMID 21233348.Zhang, B.; Arun, G.; Mao, Y. S.; Lazar, Z.; Hung, G.; Bhattacharjee, G.; Xiao, X.; Booth, C. J.; Wu, J.; Zhang, C.; Spector, D. L. (2012). "The lncRNA Malat1 is Dispensable for Mouse Development but Its Transcription Plays a cis-Regulatory Role in the Adult". Cell Reports 2 (1): 111–23. doi:10.1016/j.celrep.2012.06.003. PMC 3408587. PMID 22840402.Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, S. H.; Lee, I.; Johnson, B. H.; Kang, G. -Y.; Bang, J. Y.; Park, H. S.; Leelayuwat, C.; Lee, Y. S. (2011). "Precursor miR-886, a novel noncoding RNA repressed in cancer, associates with PKR and modulates its activity". RNA 17 (6): 1076. doi:10.1261/rna.2701111. PMID 21518807. ou o microARN en células e tecidos. A FISH utilízase para examinar o ciclo de reprodución celular, especificamente os núcleos en interfase para detectar calquera anormalidade cromosómica.Bernasconi, B.; Karamitopolou-Diamantiis, E.; Tornillo, L.; Lugli, A.; Di Vizio, D.; Dirnhofer, S.; Wengmann, S.; Glatz-Krieger, K.; Fend, F.; Capella, C.; Insabato, L.; Terracciano, L. M. (2008). "Chromosomal instability in gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas: A fluorescent in situ hybridization study using a tissue microarray approach". Human Pathology 39 (4): 536–42. doi:10.1016/j.humpath.2007.08.009. PMID 18234275. Con esta técnica pódese analizar moito máis facilmente unha gran serie de casos arquivados para así identificar o cromosoma que se localiza porque ten puntos fluorescentes, creando unha sonda baseándose nun cromosoma artificial que sirva para atraer a cromosomas similares. A hibridación sinaliza para cada sonda cando se detecta unha anormalidade nuclear. Cada sonda para a detección de ARNms e ARNs non codificantes longos está composta por 20 pares de oligonucleótidos, e cada un deses pares cobre un espazo de 40-50 bp. Para a detección de microARN, as sondas usan química propietaria (de marca comercial) para a detección, e cobren a secuencia completa do microARN. miniatura|dereita|Células uroteliais marcadas con catro sondas diferentes. As sondas a miúdo derivan de fragmentos de ADN que foron illados, purificados e amplificados para o seu uso no Proxecto Xenoma Humano. O tamaño do xenoma humano é tan grande, comparado coa lonxitude que se podería secuenciar directamente, que foi necesario dividir o xenoma en fragmentos. Na análise final estes fragmentos ordénanse dixerindo unha copia de cada fragmento en fragmentos aínda máis pequenos usando endonucleases específicas de secuencia, medindo o tamaño de cada pequeno fragmento utilizando cromatografía de exclusión por tamaños, e empregando esa información para determinar onde se solapan os fragmentos grandes. Para preservar os fragmentos coas súas secuencias de ADN individuais, os fragmentos engádense a un sistema con poboacións bacterianas en continua replicación, e quedan almacenados no interior das bacterias. As poboacións clonais de bacterias, cada unha das cales mantén un só cromosoma artificial, almacénanse en varios laboratorios de todo o mundo. Os cromosomas artificiais (BAC) poden ser extraídos e etiquetados nun laboratorio. Estes fragmentos teñen da orde de 100 mil pares de bases, e son a base da maioría das sondas de FISH.

Preparación e hibridación de ARN Para permitir o acceso á diana as células, células tumorais circulantes (CTCs), ou incluídas en parafina e fixadas con formaldehido ou preparacións de tecidos conxelados deben ser primeiro fixadas, e despois permeabilizadas. A FISH tamén se utilizou con éxito con células non fixadas. Unha sonda específica para unha diana, composta de 20 pares de oligonucleótidos, hibrida co(s) ARN(s) diana. Sistemas de amplificación compatibles pero separados permiten facer ensaios múltiples (ata dúas dianas por ensaio). A amplificación do sinal conséguese por medio dunha serie de pasos de hibridación secuenciais. Ao final do ensaio as mostras de tecidos visualízanse baixo o microscopio de fluorescencia.

Preparación e hibridación do ADN

miniatura|dereita|Esquema dos principios dun experimento de FISH para localizar un xene no núcleo.

Primeiro, constrúese unha sonda. A sonda debe ser grande dabondo como para poder hibridarse especificamente coa súa diana pero non tan grande que impida o proceso de hibridación. A sonda é marcada directamente con fluoróforos, con dianas para anticorpos ou con biotina. Esta marcaxe pode facerse de varias maneiras, como por nick translation, ou por PCR usando nucleótidos marcados.

Despois faise unha preparación de cromosomas en metafase ou núcleos en interfase. Os cromosomas están firmemente unidos a un substrato, xeralmente vidro. Deben bloquearse as secuencias de ADN repetitivas engadindo curtos fragmentos de ADN á mostra. A sonda é despois aplicada ao ADN do cromosoma e incubada durante aproximadamente 12 horas mentres se hibrida. Fanse varios lavados que eliminan todas as sondas non hibridadas ou parcialmente hibridadas. Os resultados visualízanse despois e cuantifícanse usando un microscopio que poida excitar a marcaxe fluorescente e gravar as imaxes.

Se o sinal fluorescente é feble, pode ser necesaria a amplificación do sinal para que se supere o limiar de detección do microscopio. A forza do sinal fluorescente depende de moitos factores, como a eficiencia do etiquetado das sondas, o tipo de sonda e o tipo de tinguidura. Á molécula de tinguidura únense anticorpos marcados fluorescentemente ou estreptavidina. Estes compoñentes secundarios son seleccionados para que teñan un sinal forte.

Variacións nas sondas e análises miniatura|dereita|Células en interfase positivas para o rearranxo cromosómico t(9;22).

A FISH é unha técnica moi xeral. As diferenzas entre as varias técnicas de FISH débense xeralmente a variacións na secuencia e etiquetado das sondas; e a como se usan estas en combinación. As sondas son divididas en dúas categorías xenéticas: celular e acelular. O termo "In situ" na FISH refírese á situación da sonda, que se sitúa nas propias células.

O tamaño das sondas é importante porque as sondas máis grandes hibridan menos especificamente que as máis curtas; "unha curta febra de ADN ou ARN (xeralmente de 10 a 25 nucleótidos) que é complementaria dunha secuencia diana dada, pode usarse para identificar ou localizar a diana.". O solapamento define a resolución das características detectables. Por exemplo, se o obxectivo dun experimento é detectar o punto de rotura dunha translocación, entón o solapamento das sondas (o grao no que a secuencia de ADN está contida nas sondas adxacentes) define a fiestra mínima na cal se pode detectar o punto de rotura.