Unha micromatriz de proteínas (protein microarray), chip de proteínas ou microarranxo de proteínas é un método de alto rendemento usado para estudar as interaccións e actividades das proteínas e determinar as súas funcións, e as funcións a grande escala. A súa principal vantaxe débese a que se poden estudar en paralelo un gran número de proteínas. O chip consta dunha superficie de soporte como unha lámina de vidro, membrana de nitrocelulosa, bólas, ou placa de microtitulación, á cal se une unha matriz (array) de proteínas de captura. Engádense á matriz moléculas usadas como sondas, normalmente etiquetadas con tinguidura fluorescente. Calquera reacción entre a sonda e as proteínas inmobilizadas emite un sinal fluorescente que se le por medio dun escáner láser. As micromatrices de proteínas son de funcionamento rápido, automatizado, son económicas e moi sensibles, e só consomen pequenas cantidades de mostras e reactivos. O concepto e metodoloxía das micromatrices de proteínas foi introducido e ilustrado primeiramente en micromatrices de anticorpos ou antibody microarrays (tamén chamadas matrices de anticorpos) en 1983 nunha publicación científica e unha serie de patentes.patent US 4591570 ; patent US 4829010 ; patent US 5100777 . A tecnoloxía de alto rendemento que está detrás das micromatrices de proteínas foi relativamente doada de desenvolver, xa que estaba baseada na tecnoloxía desenvolvida para as micromatrices de ADN, que se converteran nas micromatrices máis amplamente utilizadas.
Motivación para o desenvolvemento
As micromatrices de proteínas desenvolvéronse debido ás limitacións que tiña o uso de micromatrices de ADN para determinar os niveis de expresión xénica en proteómica. As cantidades de ARNm na célula adoitan non reflectir os niveis de expresión das proteínas ás que corresponden. Como xeralmente é a proteína e non o ARNm a que ten o papel funcional na resposta da célula, cumpría utilizar unha estratexia nova centrada nas proteínas. Ademais as modificacións postraducionais, que son a miúdo críticas para determinar a función da proteína, non son visibles nas micromatrices de ADN. As micromatrices de proteínas substitúen as técnicas proteómicas tradicionais como a electroforese en xel bidimensional ou a cromatografía, que requiren bastante tempo e moito traballo e non son as máis axeitadas para analizar proteínas pouco abundantes.
Construción da matriz
As proteínas sitúanse nunha superficie sólida como un portaobxectos de microscopía, membranas, bólas ou placas de microtitulación. A función desta superficie é proporcionar un soporte sobre o cal poidan inmobilizarse as proteínas. Este debería ter propiedades de unión máximas e á vez manter a conformación nativa da proteína para que se conserven as súas capacidades de unión a moléculas. Os portaobxectos feitos de vidro ou silicona son moi utilizados porque son compatibles con colocadores das proteínas robóticos habituais e os escáneres láser que foron desenvolvidos para a tecnoloxía das micromatrices de ADN. As láminas de película de nitrocelulosa son as máis aceptadas como o substrato coa máxima capacidade de unión para proteínas nas aplicacións das micromatrices de proteínas.
A superficie sólida elixida é despois cuberta cun recubrimento que debe desempeñar simultaneamente as funcións de inmobilizar a proteína, impedir a súa desnaturalización, orientala na dirección apropiada para que os sitios de unión sexan accesibles, e proporcionar un ambiente hidrófilo no cal poida ocorrer a reacción de unión. Ademais, tamén necesita presentar unha capacidade de unión non específica o menor posible para minimizar o ruído de fondo no sistema de detección. Ademais, debe ser compatible con diferentes sistemas de detección. Entre os axente inmobilizadores están capas de aluminio ou ouro, polímeros hidrófilos e xeles de poliacrilamida, ou tratamentos con aminas, aldehidos ou epoxis. Empréganse tecnoloxías de capa fina como a deposición de vapor física (PVD) e a deposición de vapor química (CVD) para aplicar a cuberta á superficie de soporte.
É esencial un ambiente acuoso en todas as fases de fabricación dunha micromatriz e operar de modo que se impida a desnaturalización das proteínas. Por tanto, hai que regular coidadosamente os tampóns de mostra para que conteñan unha alta porcentaxe de glicerol (para diminuír o punto de conxelación) e a humidade do ambiente de fabricación. Os micropozos teñen a dobre vantaxe de que proporcionan un ambiente acuoso á vez que impiden a contaminación cruzada entre mostras.
No tipo máis común de matriz proteica, os robots sitúan grandes cantidades de proteínas ou os seus ligandos sobre un soporte sólido cuberto cun padrón predefinido. Isto coñécese como impresión de contacto robótico ou punteado robótico (robotic spotting). Outro método de fabricación é a impresión por chorro de "tinta", un método que non toma contacto directo e deposita só cando se demanda para dispersar os polímeros proteicos sobre a superficie sólida co padrón desexado. O punteado piezoeléctrico (piezoelectric spotting) é un método similar para esta impresión por chorro. A cabeza de impresión móvese a través da matriz e en cada punto usa estmulación eléctrica para depositar as moléculas proteicas sobre a superficie por medio de diminutos chorros. Trátase tamén dun proceso sen contacto directo coa matriz. A fotolitografía é o cuarto método para dispoñer as proteínas sobre a superficie. Utilízase a luz en asociación con fotomáscaras, placas opacas con buratos ou transparencias que permiten que a luz brille a través cun padrón definido. Despois, unha serie de tratamentos químicos permiten o depósito da proteína co padrón desexado sobre o material que está baixo a fotomáscara.
As moléculas de captura dispostas sobre a superficie sólida poden ser anticorpos, antíxenos, aptámeros (ligandos baseados en ácidos nucleicos), aficorpos (ou Affibodies, pequenas moléculas preparadas por enxeñaría para imitar anticorpos monoclonais), ou proteínas completas. Entre as fontes de ditas proteínas están sistemas de expresión baseados en células para proteínas recombinantes, purificación a partir de fontes naturais, produción in vitro por sistemas de tradución libres de células e métodos de síntese para péptidos. Moitos destes métodos poden ser automatizados para unha produción de alto rendemento, mais debe terse coidado de evitar condicións de síntese ou extracción que teñan como resultado a desnaturalización das proteínas, que xa non poderían recoñecer a molécula coa que se teñen que unir, o que faría que a matriz fose inútil.
As proteínas son moi sensibles aos cambios no seu microambiente. Isto supón un reto para manter as matrices de proteínas en condicións estables durante períodos de tempo longos. Os métodos in situ, inventados e publicados por Mingyue He e Michael Taussig en 2001,US patent 7674752, Mingyue He & Michael John Taussig, "Functional protein arrays", published 2004-08-15, issued 2010-03-10, assigned to Discema Limited implican a síntese sobre o chip de proteínas como e cando se necesitan, directamente a partir do ADN que a codifica usando sistemas de expresión de proteínas libres de células. Como o ADN é unha molécula moi estable non se deteriora co tempo e, por tanto, é moi apropiada para o almacenamento a longo prazo. Este enfoque é tamén vantaxoso porque evita os laboriosos e a miúdo custosos procesos de purificación de proteínas por separado e a clonación de ADN, xa que as proteínas son producidas e inmobilizadas simultaneamente nun só paso sobre a superficie do chip. Exemplos de técnicas in situ de matrices de proteínas libres de células son: PISA (protein in situ array, matriz in situ de proteínas), NAPPA (nucleic acid programmable protein array, matriz de proteínas programable de ácido nucleico) e DAPA (DNA array to protein array, matriz de ADN para matriz de proteínas).
Tipos de matrices
miniatura|Tipos de matrices de proteínas|506x506px Hai tres tipos de micromatrices de proteínas que se usan actualmente para estudar as actividades bioquímicas das proteínas.
As micromatrices analíticas son tamén coñecidas como matrices de captura. Nesta técnica, sitúanse sobre a superficie de soporte unha biblioteca de anticorpos, aptámeros ou aficorpos (Affibodies). Estes son utilizados para capturar moléculas, xa que cada un se une especificamente a unha determinada proteína. A matriz é sondada cunha solución complexa de proteínas como un lisado celular. A análise das reaccións de unión resultantes producidas usando varios sistemas de detección pode proporcionar información sobre niveis de expresión de determinadas proteínas da mostra, así como medicións das afinidades de unión e especificidades. Este tipo de micromatriz é especialmente útil para comparar a expresión de proteínas en diferentes solucións. Por exemplo, pode identificarse a resposta das células a un determinado factor comparando os lisados das células tratadas con substancias específicas ou cultivadas baixo certas condicións cos lisados das células control. Outra aplicación é na identificación e perfil de tecidos enfermos.
As micromatrices de proteínas en fase inversa (RPPA; reverse phase protein microarray) requiren o uso de mostras complexas como os lisados de tecidos. As células íllanse de varios tecidos de interese e son lisadas. Os lisados dispóñense sobre a micromatriz e sóndanse con anticorpos contra a proteína diana de interese. Estes anticorpos son detectados tipicamente con ensaios quimioluminescentes, fluorescentes ou colorimétricos. Os péptidos de referencia imprímense sobre os portaobxectos para que se poida cuantificar a proteína dos lisados da mostra. As matrices de fase inversa (RPA) permiten a determinación da presenza de proteínas alteradas ou outros axentes que poden ser o resultado da enfermidade. Especificamente, poden detectarse usando matrices de fase inversa as modificacións postraducionais, que son tipicamente alteradas como resultado de enfermidades.
Micromatrices de proteínas funcionais
As micrfomatrices de proteínas fncionais (tamén chamadas matrices de proteínas diana) constrúense inmobilizando grandes cantidades de proteínas purificadas e utilízanse para identificar as interaccións proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN, proteína-fosfolípido e proteína-pequena molécula, para facer ensaios de actividade encimática e para detectar anticorpos e demostrar as súas especificidades. Difiren das matrices analíticas en que as matrices de proteínas funcionais están compostas de matrices que conteñen proteínas funcionais completas ou dominios proteicos. Estes chips de proteínas utilízanse para estudar as actividades bioquímicas do proteoma completo nun só experimento.
O elemento clave en calquera ensaio baseado en micromatriz de proteínas funcional é que as proteínas da matriz deben manter a súa estrutura nativa, esas significativas interaccións funcionais poden ter lugar na superficie da matriz. As vantaxes de controlar o modo preciso de unión á superficie polo uso dunha etiqueta de afinidade apropiada son que as proteínas inmobilizadas terán unha orientación homoxénea como resultado dunha actividade específica maior e unha proporción maior sinal-ruído nos ensaios, con menos interferencia de interaccións non específicas.
Detección