miniatura|300px|Esquema da xeración de células nai pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células adultas (reprogramación). (1) Íllanse e cultívanse as células adultas que se van utilizar. (2) Faise a transferencia de xenes exóxenos provenientes de células nai ás células por medio de vehículos retrovirais. As células de cor vermella son células transfectadas que xa expresan os xenes exóxenos. (3) Cultívanse as células transfectadas con métodos de cultivo de células nai usando células inactivadas como capas alimentadoras (cor gris). (4) Un subgrupo pequeno destas células transfectadas transfórmanse en células nai pluripotentes inducidas (iPS) e a partir dese momento producen colonias de células nai. miniatura|Colonias de células iPS humanas. As células con forma de fuso do fondo son fibroblastos de rato. Só as células que están no centro da colonia son células iPS humanas.
As células nai pluripotentes inducidas (normalmente abreviadas como células iPS ou iPSC, polas súas siglas en inglés de "Induced Pluripotent Stem Cells") son un tipo de células nai con características pluripotenciais (con capacidade de xeraren a maioría dos tecidos) derivadas artificialmente dunha célula que inicialmente non era pluripotencial. Xeralmente, utilízase para obtelas unha célula adulta diferenciada procedente dun tecido, sobre a que se induce a expresión de varios xenes exóxenos, tales como Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4, que poden desdiferenciala. Esta desdiferenciación denomínase reprogramación. As células iPS poden: a) diferenciarse en células de tecidos pertencentes ás tres capas xerminais dun embrión natural (ver embrioxénese humana): endoderma, mesoderma e ectoderma, b) formar teratomas, e c) orixinar ratos quiméricos ou quimeras.
Demostrouse que as células iPS son idénticas en moitos aspectos e similares noutros ás células nai embrionarias (normalmente abreviadas como ES ou ESC, polas súas siglas en inglés de "Embryonic Stem Cell"). Por exemplo, son iguais en morfoloxía, expresión de certos xenes e proteínas, padróns de metilación do ADN, tempo de duplicación celular e capacidade de diferenciación a células doutros tecidos. Porén, o mecanismo por medio do cal se inducen e a súa relación coas células ES segue aínda en investigaciónLiu J, Verma PJ, Evans-Galea MV, Delatycki MB, Michalska A, Leung J, Crombie D, Sarsero JP, Williamson R, Dottori M et al (2011). "Generation of induced pluripotent stem cell lines from Friedreich ataxia patients". Stem Cell Rev 7 (3): 703-713. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21181307).Liu SP, Fu RH, Huang YC, Chen SY, Chien YJ, Hsu CY, Tsai CH, Shyu WC, Lin SZ (2011). "Induced pluripotent stem (iPS) cell research overview". Cell Transplant 20 (1): 15-19. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20887681).
As células iPS obtivéronse por primeira vez no ano 2006 a partir de células de ratos e en 2007 a partir de células humanas. En 2006, describiuse por primeira vez este proceso a partir de fibroblastos de rato utilizando retrovirus que vehiculizaban e inducían a expresión de varios xenes exóxenos. En 2011 publicouse unha revisión sobre esta primeira metodoloxía.Miller JD, Schlaeger TM (2011). "Generation of induced pluripotent stem cell lines from human fibroblasts via retroviral gene transfer". Methods Mol Biol 767 55-65. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822867). Isto considérase un dos avances máis importantes da investigación con células nai, xa que permite obter células nai pluripotentes a partir de células adultas. As iPS teñen aplicacións como modelos para o estudo de doenzas, posibles usos terapéuticos (diminuíndo o rexeitamento nos transplantes e sen a controversia do uso de embrións que teñen as células ES), e en investigacións básicas.
Shinya Yamanaka e John Gurdon foron galardoados en 2012 co Premio Nobel de Fisioloxía ou Medicina.
Primeiros métodos de reprogramación de células adultas miniatura|400px|Esquema da xeración de células de tecidos diferenciadas a partir das células nai naturais. . Todas as células adultas que compoñen o corpo dun rato ou humano xéranse a partir dunha célula inicial totipotente a través de células nai pluripotentes, que só persisten na etapa embrionaria (células ES), e despois a partir de células nai multipotentes que persisten no adulto. A reprogramación de células adultas a células pluripotenres (células iPS) conseguiu a reversibilidade parcial deste proceso natural de diferenciación celular
Primeira xeración en ratos As células iPS derivan de células adultas por transferencia (transfección) de varios xenes exóxenos asociados a células ES. Xeralmente para unha transferencia eficiente utilízanse retrovirus que actúan como vehículos ou vectores dos xenes exóxenos. Os xenes exóxenos transferidos son principalmente os correspondentes a factores de transcrición asociados ás células ES. Tres ou catro semanas despois, unha pequena porcentaxe das células transferidas comenzan a diferenciarse volvéndose morfolóxica e bioquimicamente similares ás células ES. As células iPS ou células adultas reprogramadas íllanse por selección cun xene de resistencia a antibióticos e para confirmar a súa identidade (véxase máis adiante).
O equipo de Shinya Yamanaka da Universidade de Kyoto (Xapón) en 2006 foi o primeiro que creou células iPS. Para iso utilizaron como células diana fibroblastos de rato, e como xenes exóxenos os previamente identificados como expresados nas células ES, e como vehículos ou vectores retrovirus. Catro xenes que codificaban factores de transcrición resultaron esenciais para producir células iPS: os denominados Oct-3/4, Sox2, c-Myc e Klf4. Das células tratadas con retrovirus que codifican ditos xenes seleccionáronse só aquelas que os expresaban con antibióticos e pola presenza do xene Fbx15 (células Fbx15+). Porén, estas células iPS tiñan padróns de metilación do ADN distintos dos das células ES e ademais non producían ratos quiméricos viables.
Segunda xeración en ratos
En 2007, o mesmo grupo publicou un traballo xunto con outros grupos de investigación independentes da Universidade Harvard, o MIT e a Universidade de California, que demostraba que se podían obter células iPS a partir de fibroblastos de rato con capacidade de formar quimeras viables utilizando o xene Nanog en vez do Fbx15. Os padróns de metilación do ADN e a produción de ratos quiméricos viables indicaron que Nanog é un determinante importante da pluripotencia celular. Desafortunadamente, debido a que un dos catro xenes utilizados (c-Myc) é oncoxénico, o 20% dos ratos quiméricos desenvolveu cancro. Nun estudo posterior, demostrouse que se poden manter células iPS sen c-Myc que non desenvolven cancro, mais o procedemento é menos eficiente.Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S (2008). "Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts". Nat Biotechnol 26 (1): 101-106. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18059259).
Produción de células iPS humanas
En 2007, tamén se publicou o avance máis importante, xa que se conseguira crear células iPS humanas a partir de células humanas adultas. Os resultados obtivéronos dous equipos de investigación independentes. Un dirixido por Yamanaka no Xapón transformou fibroblastos humanos en células iPS utilizando os xenes: Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc vehiculizados en retrovirus, mentres outro dirixido por Thomson nos Estados Unidos usou os xenes Oct4, Sox2, Nanog e LIN28 vehiculizados en lentivirus.
Problemas dos primeiros métodos de reprogramación celular
Aínda que os primeiros métodos que utilizaban xenes que codificaban factores de transcrición demostraron que as células adultas diferenciadas poden reprogramarse a células iPS, aínda existen problemas importantes, tales como: i) eficiencia, ii) mutaxénese insercional, iii) tumores e iv) reprogramación incompleta.
Eficiencia: é un problema que afecta o proceso de obtención de células iPS. A eficiencia ou porcentaxe de obtención de células reprogramadas é aínda moi baixa. Por exemplo, a porcentaxe de reprogramación no estudo en ratos de Yamanaka foi só do 0,1-1% Esta porcentaxe tan baixa pode deberse á necesidade de que coincidan distintos niveis de expresión de varios dos xenes exóxenos transfectados. Tamén podería ser debido á necesidade de cambios xenéticos ou epixenéticos na poboación de células diana tal e como suxire a necesidade de tempos longos de cultivo. A optimización da reprogramación segue sendo obxecto de estudos recentes (Chen, et al. 2011)Dick E, Matsa E, Bispham J, Reza M, Guglieri M, Staniforth A, Watson S, Kumari R, Lochmuller H, Young L et al (2011). "Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines". Stem Cell Res 6 (2): 158-167. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21095172). e constantemente se producen novos avances. Por exemplo, para obter unha máxima eficiencia, nos primeiros métodos descritos cumpría que as células iPS crecesen sobre unha capa de células alimentadoras que aínda que estaban inactivadas supoñían unha posible fonte de contaminación. Con novos métodos conseguiuse facer crecer células iPS en ausencia de ditas capas en boas condiciónsChung HC, Lin RC, Logan GJ, Alexander IE, Sachdev PS, Sidhu KS (2011). "Human Induced Pluripotent Stem Cells Derived Under Feeder-Free Conditions Display Unique Cell Cycle and DNA Replication Gene Profiles". Stem Cells Dev (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21506733). e durante tempo prolongado.Nemati S, Hatami M, Kiani S, Hemmesi K, Gourabi H, Masoudi N, Alaei S, Baharvand H (2011). "Long-term self-renewable feeder-free human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors". Stem Cells Dev 20 (3): 503-514. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20632795).
Mutaxénese insercional: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. A inserción dos xenes exóxenos que codifican os factores de transcrición no xenoma da célula diana limita a súa utilidade debido ao risco de mutaxénese insercional no xenoma das células diana.Selvaraj V, Plane JM, Williams AJ, Deng W (2010). "Switching cell fate: the remarkable rise of induced pluripotent stem cells and lineage reprogramming technologies". Trends Biotechnol 28 (4): 214-223. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20149468). As mutacións introducidas poden ser deletéreas ou inducir tumores. Unha estratexia para evitar a mutaxénese insercional é o uso de vectores alternativos. Para iso exploráronse plásmidos, adenovirus e transposóns, que aínda que reducen as posibilidades de mutaxénese insercional, teñen unha eficiencia de reprogramación menor.Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K (2008). "Induced pluripotent stem cells generated without viral integration". Science 322 (5903): 945-949. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18818365).Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hamalainen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M et al (2009). "piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells". Nature 458 (7239): 766-770. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19252478). Outras estratexias que empregan proteínas ou ARN tamén teñen unha eficiencia menor. Por último, o emprego de moléculas de baixo peso molecular que simulan o efecto dos factores de transcrición parece hoxe por hoxe a alternativa máis esperanzadora.