Unha etiqueta FLAG (FLAG-tag), octapéptido FLAG ou epítopo FLAG é un péptido que funciona como etiqueta proteica que se pode engadir a unha proteína usando a tecnoloxía do ADN recombinante, que ten a secuencia DYKDDDDK (onde D=ácido aspártico, Y=tirosina e K=lisina). É unha das etiquetqs máis específicas e é un antíxeno artificial para o cal se desenvolveron anticorpos monoclonais específicos de alta afinidade e, por tanto, pode usarse para a purificación de proteínas por cromatografía de afinidade e tamén pode usarse para a localización de proteínas dentro das célula vivas. A etiqueta FLAG utilizouse para separar proteínas recombinantes sobreexpresadas a patir da proteína de tipo salvaxe expresada polo organismo hóspede. A etiqueta FLAG pode tamén usarse no illamento dos complexos proteicos con múltiples subunidades, porque o procedemento de putrificación suave da etiqueta FLAG tende a non distorsionar tales complexos. A purificación baseada en etiquetas FLAG foi utiizada para obter proteínas de suficiente pureza e calidade pata levar a cabo a determinación da estrutura 3D por cristalografía de raios X.
A etiqueta FLAG pode utilizarse en moitos tipos de ensaios que requiren o recoñecemento por un anticorpo. Se non hai nigún anticorpo contra unha determinada proteína, engadir unha etiqueta FLAG a unha proteína permite estudar a proteína cun anticorpo contra a secuencia da etiqueta FLAG. Exemplos son os estudos de localización celular por inmunofluorescencia, inmunoprecipitación ou detección por electroforese de proteínas SDS-PAGE e Western blotting.
A secuencia do péptido dunha etiqueta FLAG desde o N-terminal ao C-terminal é: DYKDDDDK (1012 Da). Ademais, as etiquetas FLAG poden usarse en tándem, normalmente o péptido 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (coa etiqueta final que codifica un sitio de corte dunha enteroquinase). A etiqueta FLAG pode fusionarse co C-terminal ou o N-terminal dunha proteína ou inserirse nunha proteína. Algúns dos anticorpos comercialmente dispoñibles (por exemplo, M1/4E11) recoñecen o epítopo só cando a etiqueta FLAG está presente no N-terminal. Porén, outros anticorpos dispoñibles (por exemplo, M2) son insensibles á posición. O residuo de tirosina na etiqueta FLAG pode ser sulfatado cando se expresa en certas proteínas segregadas, o cal pode afectar o recoñecemento polos anticorpos do epítopo FLAG. A etiqueta FLAG pode utilizarse en conxunción con outras etiquetas de afinidade, por exemplo unha etiqueta de polihistidina (His-tag), HA-tag ou myc-tag).
Historia
O primeiro uso da etiquetaxe de epítopos describírono Munro e Pelham en 1984. A etiqueta FLAG foi o segundo exemplo dunha etiqueta de epítopo mellorada completamente funcional, publicada na literatura científica. e era a única etiqueta de epitopo patentada.FLAG é unha marca rexistrada de Sigma-Aldrich Co. LLC. US patent 4703004, Hopp, Thomas P; Bektesh, Susan & Conlon 3rd., Paul J et al., "Synthesis of protein with an identification peptide", published 1987-10-27, assigned to Immunex Corp. Desde entón converteuse nunha das etiquetas proteicas máis usadas nos laboratorios de todo o mundo. A diferenza dalgunhas outras etiquetas (por exemplo, myc, HA), nas que primeiro se illou un anticorpo monoclonal contra unha proteína existente e despois o epítopo foi caracterizado e usado como etiqueta, o epítopo FLAG era un deseño artificial idealizado, para o cal se crearon anticorpos monoclonais. A secuencia da etiqueta FLAG foi optimizada para a compatibilidade con proteínas ás que se une, xa que a etiqueta FLAG é máis hidrófila que outras etiquetas de epítopos comúns e, por tanto, menos probable que reduza a actividade de proteínas ás cales se lles colga a etiqueta FLAG. Ademais, as etiuetas FLAG N-terminais poden ser retiradas facilmente de proteínas unha vez que foron illadas, polo tratamento coa protease específica, a enteroquinase (enteropeptidase).
O terceiro informe de etiquetaxe de epítopos (o HA-tag), apareceu aproximadamente un ano despois do sistema FLAG.
Notas
Véxase tamén Outros artigos Etiqueta proteica SpyTag
Categoría:Técnicas de laboratorio Categoría:Bioloxía molecular Categoría:Secuencias peptídicas Categoría:Péptidos