A secuenciación do ADN é o proceso de determinar a orde precisa de nucleótidos dunha molécula de ADN. Para facer a secuenciación aplícanse diversos métodos e tecnoloxías que permiten determinar a orde das catro bases (adenina, guanina, citosina, e timina) que forman as cadeas do ADN. A aparición de métodos rápidos de secuenciación acelerou moito as investigacións e descubrimentos médicos e biolóxicos.
O coñecemento das secuencias de ADN fíxose indispensable para unha investigación biolóxica básica, e en numerosos campos aplicados como o diagnóstico, biotecnoloxía, bioloxía forense, e sistemática biolóxica. As rápidas velocidades de secuenciación acadadas coas modernas tecnoloxías de secuenciación do ADN foron fundamentais para a secuenciación de secuencias de ADN completas, ou mesmo xenomas completos de numerosas especies vivas, incluíndo o xenoma humano e outros xenomas de animais, plantas e microorganismos. miniatura|Exemplo dos resultados dunha secuenciación de ADN de terminación de cadea automatizada.
As primeiras secuencias de ADN obtivéronse a inicios da década de 1970 utilizando laboriosos métodos baseados na cromatografía bidimensional, e co desenvolvemento de métodos de secuenciación baseados na fluorescencia con análise automatizada, a secuenciación do ADN fíxose máis fácil e moitísimo máis rápida.
Usos da secuenciación A secuenciación do ADN pode utilizarse para determinar a secuencia dun determinado xene, de rexións xenéticas grandes (por exemplo, clusters de xenes ou operóns), cromosomas completos ou xenomas enteiros. Dependendo dos métodos utilizados, a secuenciación pode determinar a orde dos nucleótidos dun ADN ou ARN illado dunha célula de animal, planta, bacteria, arquea, ou virtualmente de calquera outra fonte de información xenética. As secuencias resultantes poden utilizarse en bioloxía molecular ou xenética para facer progresos científicos ou pode utilizalos o persoal médico para tomar decisións de tratamento ou para dar consello xenético.
Historia Aínda que en 1953 se estableceu que a estrutura do ADN era unha dobre hélice, pasarían varias décadas antes de que fose posible analizar fragmentos de ADN para determinar a súa secuencia. A secuenciación do ARN foi unha das primeiras formas de secuenciación de nucleótidos. O punto culminante da secuenciación do ARN foi a obtención da secuencia do primeiro xene completo e o xenoma completo do bacteriófago MS2, identificado e publicado por Walter Fiers e colaboradores na Universidade de Gante (Bélxica), en 1972 e 1976.
Fixéronse varios avances notables na secuenciación do ADN durante a década de 1970. Frederick Sanger desenvolveu métodos de secuenciación do ADN rápidos no Consello de Investigacións Médicas, de Cambridge, Reino Unido, e publicou un método para a "secuenciación do ADN con inhibidores da terminación da cadea" en 1977. Walter Gilbert ed Allan Maxam na Universidade Harvard tamén desenvolveron métodos de secuenciación, como a "secuenciación de ADN por degradación química".Gilbert, W. DNA sequencing and gene structure. Nobel lecture, 8 December 1980. En 1973, Gilbert e Maxam obtiveron unha secuencia de 24 pares de bases usando un método coñecido como análise de punto errante. Sumáronse novos avances na secuenciación co desenvolvemento simultáneo da tecnoloxía do ADN recombinante, que permitiu que fosen illadas mostras de ADN doutras fontes distintas de virus.
O primeiro xenoma de ADN completo en ser secuenciado foi o do bacteriófago φX174 en 1977. Os científicos do Consello de Investigacións Médicas británico descifraron a secuencia completa do ADN do virus de Epstein-Barr en 1984, e atoparon que tiña 170 mil pares de bases.
O laboratorio de Leroy E. Hood no Instituto Tecnolóxico de California anunciou a primeira máquina de secuenciación de ADN semiautomática en 1986. Seguidamente Applied Biosystems comercializou a primeira máqueina de secuenciación totalmente automatizada, a ABI 370, en 1987. En 1990, os Institutos Nacionais da Saúde (NIH) estadounidenses empezaron unha serie de ensaios de secuenciación a grande escala de Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, e Saccharomyces cerevisiae cun custo de 0,75 dólares por base. Mentres, empezou a secuenciación de secuencias de ADNc humano chamadas etiquetas de secuencia expresadas no laboratorio de Craig Venter, nun intento de capturar a fracción codificante do xenoma humano. En 1995, Venter, Hamilton Smith, e colegas en The Institute for Genomic Research (TIGR) publicaron o primeiro xenoma completo dun organismo de vida libre, a bacteria Haemophilus influenzae. O seu cromosoma circular contiña 1.830.137 bases e a súa publicación na revista Science supuxo o primeiro uso publicado da escopeta de secuenciación dun xenoma completo, eliminando a necesidade de facer un traballo inicial de mapado. En 2001, usáronse os métodos da escopeta de secuenciación para producir unha secuencia borrador do xenoma humano.
Desenvolvéronse outros varios métodos de secuenciación do ADN a mediados e finais da década de 1990. Estas técnicas comprenden as primeiras dos "métodos de secuenciación de seguinte xeración". En 1996, Pål Nyrén e o seu axudante Mostafa Ronaghi no Instituto de Tecnoloxía Real de Estocolmo publicaron o seu método de pirosecuenciación. Un ano despois, Pascal Mayer e Laurent Farinelli rexistraron unha patente describindo a secuenciación de colonia de ADN.Eric H. Kawashima, Laurent Farinelli, Pascal Mayer. Patent: Method of nucleic acid amplification. Acceso 2012-12-22. Data 2005-05-12. Lynx Therapeutics publicou e comercializou o seu "MPSS" en 2000. Este método incorporaba unha tecnoloxía de secuenciación baseada en esferas de polímero mediadas por adaptador/ligador en paralelo, que foi o primeiro método de secuenciación de "seguinte xeración" dispoñible, aínda que non se venderon secuenciadores de ADN a outros laboratorios. En 2004, 454 Life Sciences comercializou unha versión paralelizada de pirosecuenciación. A primeira versión da súa máquina reduciu o custo da secuenciación á sesta parte comparado cos métodos automatizados de Sanger, e foi o segundo da nova xeración de tecnoloxías de secuenciación, despois da MPSS.
As grandes cantidades de datos producidos pola secuenciación do ADN precisaron tamén o desenvolvemento de novos métodos e programas para a análise de secuencias. Phil Green e Brent Ewing da Universidade de Washington describiron a súa puntuación de calidade para o programa Phred para análises de datos de secuenciador en 1998.
Métodos básicos
Secuenciación de Maxam e Gilbert
Allan Maxam e Walter Gilbert publicaron un método de secuenciación do ADN en 1977 baseado na modificación química do ADN e a subseguinte clivaxe en bases específicas. Tamén coñecido como secuenciación química, este método permitiu purificar mostras de ADN de dobre cadea para ser usadas sen unha posterior clonación. O uso neste método do etiquetado radioactivo e a súa complexidade técnica desanimou o seu uso amplo unha vez que se fixeron refinamentos nos métodos de Sanger.
A secuenciación de Maxam e Gilbert require o etiquetado radioactivo nun extremo 5' do ADN e a purificación do fragmento de ADN que vai ser secuenciado. O tratamento químico xera despois roturas nunha pequena proporción dunha ou dúas das catro bases nucleotídicas en cada unha das catro reaccións (G, A+G, C, C+T). A concentración dos compostos modificadores é controlada para introducir como media unha modificación por molécula de ADN. Desrte modo, xérase unha serie de fragmentos etiquetados, desde o extremo radioetiquetado ao primeiro sitio de "corte" en cada molécula. Os fragmentos nas catro reaccións son sometidos a electroforese xuntos en xeles de acrilamida desnaturalizantes para a súa separación por tamaños. Para visualizar os fragmentos, o xel é exposto a película de raios X para autorradiografía, dando lugar a unha serie de bandas escuras cada unha correspondente a un fragmento de ADN radioetiquetado, do cal se pode deducir a secuencia.
Métodos de terminación de cadea
O método de terminación de cadea desenvolvido por Frederick Sanger e colaboradores en 1977 axiña se converteu no método preferido de secuenciación debido á súa relativa simplicidade e fiabilidade. O método de terminación de cadea usaba menos compostos tóxicos e menor cantidade de radioactividade que o método de Maxam e Gilbert. Debido á súa comparativa sinxeleza, o método de Sanger foi axiña automatizado e foi o método utilizado pola primeira xeración de secuenciadores de ADN.
A secuenciación de Sanger é o método que prevaleceu desde a década de 1980 ata mediados da década do 2000. Nese período, fixéronse grandes avances na técnica, como o etiquetado fluorescente, a electroforese capilar, e a automatización xeral. Estas melloras permitían unha secuenciación moito máis efeiciente, o que reduciu os seus custos. O método de Sanger, aplicado masivamente, é a tecnoloxía coa que se obtivo o primeiro xenoma humano en 2001, marcando o comezo da idade da xenómica. Porén, avanzada a década, chegaron ao mercado técnicas con estratexias totalmente diferentes, que rebaixaron o custo por xenoma desde uns 100 millóns de dólares en 2001 a só 10.000 en 2011.
Métodos avanzados e secuenciación de novo
miniatura|dereita|O ADN xenómico é fragmentado en anacos aleatoriamente e clonado nunha libraría bacteriana. O ADN dun clon de bacterias secuénciase e a secuencia ensámblase usando rexións solapadas do ADN. A secuenciación a grande escala con frecuencia pretende secuenciar fragmentos de ADN moi longos, como cromosomas enteiros, aínda que a secuenciación a grande escala pode tamén usarse para xerar cantidades moi grandes de secuencias curtas, como as que se encontran na técnica do phage display. Para obxectivos máis longos como os cromosomas, a estratexia máis común consiste en cortalos en anacos máis pequenos con encimas de restrición ou rompelos aplicando forzas mecánicas. O ADN fragmentado pode despois ser clonado nun vector de ADN e amplificado nun hóspede bacterianao como Escherichia coli. Os fragmentos curtos de ADN purificados dunha colonia bacteriana son secuenciados por separado e ensamblados electónicamente nunha longa secuencia continua.
O termo "secuenciación de novo" (en latín, "desde o principio") refírese especificamente aos métodos usados para determinar a secuencia dun ADN cuxa secuencia non se coñece previamente. As lagoas que queden na secuencia ensamblada poden encherse utilizando a técnica primer walking. As distintas estratexias teñen diferentes vantaxes en velocidade e precisión; os métodos de escopeta son moi utilizados para secuenciar xenomas grandes, pero a súa ensamblaxe é complexa e difícil, especialmente con repeticións de secuencia, que con frecuencia orixinan lagoas durante a ensamblaxe do xenoma.
A maioría das estratexias de secuenciación usan un paso de clonación in vitro para amplificar cada molécula de ADN, porque os seus métodos de detección molecular non son sensibles dabondo como para secuenciar unha soa molécula. Unha PCR de emulsión illa moléculas de ADN por separado con esferas cubertas cun cebador en gotas acuosas dentro dunha fase de aceite. Despois aplícase a reacción en cadea da polimerase (PCR) para cubrir cada esfera con copias clonais de moléculas de ADN que despois se inmobilizan para unha posterior secuenciación. A PCR de emulsión utilízase nos métodos desenvolvidos por Marguilis et al. (comercializados por 454 Life Sciences), Shendure e Porreca et al. (tamén coñecidos como "secuenciación Polony", contracción de polymerase colony) e secuenciación SOLiD, (desenvolvida pola compañía Agencourt, despois chamada Applied Biosystems, e agora Life Technologies).
Secuenciación de escopeta