miniatura|Polietilenoglicol. A PEGilação é o processo que consiste na união ou amalgamação covalente ou não covalente de cadeias de polímeros de polietilenoglicol (PEG, em farmácia chamado macrogol) a moléculas e macroestruturas, como fármacos, proteínas terapêuticas ou lipossomas, que então se diz que estão PEGiladas. A PEGilação afeta as interações derivadas ou agregadas resultantes, que normalmente tornam mais lenta a coalescência e degradação destes produtos, bem como a sua eliminação do organismo in vivo.
A PEGilação é conseguida rotineiramente por incubação de um derivado reativo do PEG com a molécula alvo. A união covalente do PEG a um fármaco ou proteína terapêutica pode "mascarar" o agente perante o sistema imunitário do hospedeiro (reduzindo a imunogenicidade e antigenicidade), e aumenta o seu tamanho hidrodinâmico (tamanho em solução), o que prolonga o seu tempo circulatório ao reduzir a sua eliminação renal. A PEGilação pode também proporcionar hidrossolubilidade a fármacos e proteínas que eram hidrófobos. A tecnologia da PEGilação, que demonstrou as suas vantagens farmacológicas e aceitabilidade, converteu-se na base de uma indústria em crescimento que movimenta milhares de milhões de dólares.
Metodologia
400px|miniatura|Uma comparação da uricase e da PEG-uricase; a PEG-uricase inclui 40 polímeros de PEG de 10 kDa. A PEGilação melhora a sua solubilidade a pH fisiológico, aumenta a semivida no soro e reduz a imunogenicidade sem comprometer a sua atividade. As imagens superiores mostram o tetrâmero completo, enquanto as inferiores mostram uma das lisinas que está PEGilada. (uricase de e modelo da PEG-uricase da referência; apenas são incluídos 36 polímeros PEG).
A PEGilação é o processo de unir as cadeias do polímero de PEG a moléculas, tipicamente péptidos, proteínas e fragmentos de anticorpos, o que pode melhorar a segurança e a eficiência de muitas terapias. Produz alterações em propriedades físico-químicas como mudanças na conformação, união eletrostática, hidrofobia etc. Estes mudanças físicas e químicas aumentam a retenção sistémica do agente terapêutico. Além disso, podem influenciar a afinidade de união do resíduo terapêutico aos recetores da célula e podem alterar os padrões de absorção e distribuição.
Como a PEGilação aumenta o peso molecular de uma molécula, pode conferir várias vantagens farmacológicas significativas em relação à forma não modificada, como melhorar a solubilidade de um fármaco, reduzir a frequência das doses, o que pode reduzir a toxicidade sem diminuir a eficácia, ampliar a vida em circulação, aumentar a estabilidade do fármaco e aumentar a proteção contra a degradação proteolítica; as formas PEGiladas podem também ser patenteadas.
Fármacos PEGilados
Em 1970, foi relatada a união de um polímero inerte e hidrófilo primariamente para aumentar a vida no sangue e o controlo da imunogenicidade de proteínas. O polietilenoglicol foi o polímero escolhido. Em 1981, Davis e Abuchowski fundaram a Enzon, Inc., que colocou no mercado três fármacos PEGilados. Abuchowski fundou posteriormente e foi o diretor executivo da Prolong Pharmaceuticals.
O valor clínico da PEGilação está agora bem estabelecido. O ADAGEN (pegademase bovina) fabricado pela Enzon Pharmaceuticals, Inc., EUA foi a primeira proteína PEGilada aprovada pela FDA americana em março de 1990 a ser lançada no mercado. É usado para tratar uma forma grave de síndrome de imunodeficiência combinada grave (SCID), como alternativa ao transplante de medula óssea e à substituição de enzimas por terapia génica. Desde a introdução do ADAGEN, um grande número de proteínas e péptidos PEGilados foi introduzido como medicamentos, e muitos outros estão em ensaios clínicos ou em diversas fases de desenvolvimento. As vendas dos dois produtos mais bem-sucedidos, Pegasys e Neulasta, ultrapassaram os 5 mil milhões de dólares em 2011.Klauser, Alexander (Head), Roche Group Media Relations, "Roche in 2011: Strong results and positive outlook," www.roche.com/med-cor-2012-02-01-e.pdf, Feb 1, 2012, p.7"Amgen 2011 Annual Report and Financial Summary," 2011 AnnualReport.pdf, Feb 23 2012, p. 71 Todos os fármacos PEGilados comercialmente disponíveis contêm metoxipoli(etilenoglicol) ou mPEG. Os fármacos PEGilados no mercado (em ordem cronológica inversa do ano de aprovação pela FDA) são:
Um lípido PEGilado é usado como excipiente tanto na vacina da Moderna como na vacina da Pfizer-BioNTech contra a COVID-19. Ambas são vacinas de RNA que consistem num RNA mensageiro (mRNA), encapsulado numa bolha de moléculas lipídicas. É utilizada tecnologia de lípidos patenteada em cada uma. Em ambas as vacinas, as bolhas estão cobertas com uma molécula estabilizadora de polietilenoglicol. Houve uma pequena percentagem de casos de reações alérgicas ao PEG. A molécula PEGilada da vacina da Moderna chama-se DMG-PEG 2000. Pegvaliase (Biomarin) – Fenilalanina amoníaco-liase recombinante PEGilada para o tratamento da fenilcetonúria, aprovada pela FDA nos EUA em maio de 2018. Adynovate – Fator VIII anti-hemofílico PEGilado para o tratamento de pacientes com hemofilia A. (Baxalta, 2015) Irinotecano lipossomal (Onivyde) – Irinotecano cloridrato tri-hidratado lipossomal PEGilado para o tratamento do cancro pancreático metastático em adultos que estão a ser tratados com gemcitabina. (Ipsen, 2015) Plegridy – Interferão Beta-1a PEGilado para o tratamento de pacientes com formas recorrentes de esclerose múltipla. (Biogen, 2014) Naloxegol (Movantik) – Naloxol PEGilado para o tratamento de obstipação induzida por opioides em pacientes adultos com dor crónica não cancerosa (a metadona não PEGilada pode causar reações intestinais adversas). (AstraZeneca, 2014) Peginesatide (Omontys) – Medicamento que se toma uma vez por mês para tratar a anemia associada à doença renal crónica em pacientes adultos submetidos a diálise (Affymax/Takeda Pharmaceuticals, 2012) Pegloticase (Krystexxa) – Uricase PEGilada para o tratamento da gota (Savient, 2010) Certolizumab pegol (Cimzia) – Anticorpo monoclonal para o tratamento de artrite reumatóide de moderada a grave e da doença de Crohn, um distúrbio inflamatório intestinal (Nektar/UCB Pharma, 2008) Metoxi polietilenoglicol-epoetina beta (Mircera) – Forma PEGilada da eritropoetina para combater a anemia associada à doença renal crónica (Roche, 2007) Pegaptanib (Macugen) – Usado para tratar a degeneração macular neovascular relacionada com a idade (Pfizer, 2004) Pegfilgrastim (Neulasta) – Fator estimulante de colónias de granulócitos humano metionil recombinante PEGilado para neutropenia grave induzida pela quimioterapia contra o cancro (Amgen, 2002) Pegvisomant (Somavert) – Uma muteína antagonista do recetor da PEG-hormona do crescimento humana para o tratamento da acromegalia (Pfizer, 2002) Peginterferon alfa-2a (Pegasys) – Interferão alfa PEGilado para uso no tratamento da Hepatite C crónica e hepatite B (Hoffmann-La Roche, 2002) Peginterferão alfa-2b (PegIntron) – Interferão alfa PEGilado para uso no tratamento da Hepatite C crónica e hepatite B (Schering-Plough/Enzon, 2000) Doxorrubicina HCl lipossomal (Doxil/Caelyx) – Lipossoma PEGilado contendo doxorrubicina para o tratamento do cancro (Alza, 1995) Pegaspargase (Oncaspar) – L-asparaginase PEGilada para o tratamento da Leucemia linfoblástica aguda em pacientes que são hipersensíveis à forma não modificada nativa da L-asparaginase (Enzon, 1994). Este fármaco foi recentemente aprovado para uso em casos especiais. Pegademase bovina (Adagen) – PEG-adenosina desaminase para o tratamento da Imunodeficiência combinada grave (SCID) (Enzon, 1990)
Litígios de Patentes O sistema de entrega de fármacos em nanopartículas (LNP) lipídicas PEGiladas das vacinas de mRNA conhecidas como mRNA-1273 foi objeto de um litígio de patentes atual com a Arbutus Biopharma, da qual a Moderna obteve anteriormente licença da tecnologia LNP. Em 4 de setembro de 2020, a Nature Biotechnology noticiou que a Moderna perdeu uma parte crucial no caso judicial em curso sobre propriedade intelectual.
Uso em Investigação A PEGilação tem usos práticos em biotecnologia para a entrega de proteínas, transfeção de células, e edição do genoma em células não humanas.
Procedimento O primeiro passo da PEGilação é a adequada funcionalização do polímero de PEG numa ou em ambas as extremidades. Os PEGs que são ativados em cada extremidade com o mesmo resíduo reativo denominam-se "homobifuncionais", enquanto se os grupos funcionais presentes forem diferentes, o derivado de PEG é denominado "heterobifuncional" ou "heterofuncional". Os derivados quimicamente ativos ou ativados do polímero de PEG são preparados para que o PEG se ligue à molécula desejada.
O processo global de PEGilação usado até agora para a conjugação de proteínas pode ser classificado em dois grandes tipos: um processo em lotes de fase em solução e um processo em lotes alimentado em coluna. O processo em lotes que geralmente se adota envolve a mistura dos reagentes juntamente com uma solução tampão apropriada, preferencialmente a uma temperatura entre 4 e 6 °C, seguida da separação e purificação do produto desejado usando uma técnica apropriada baseada nas suas propriedades físico-químicas, como a cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), cromatografia de troca iónica (IEX), cromatografia de interações hidrofóbicas (HIC) e sistemas de duas fases aquosos ou de membrana (ATPS).
A escolha do grupo funcional apropriado para o derivado de PEG baseia-se no tipo de grupo reativo disponível na molécula que será acoplada ao PEG. Para as proteínas, os aminoácidos reativos típicos são os seguintes: lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e tirosina. O grupo amino N-terminal e o carboxilo C-terminal podem também ser usados como sítios específicos de sítio por conjugação com polímeros funcionais aldeído.
As técnicas usadas para formar derivados do PEG de primeira geração geralmente envolvem a reação do polímero de PEG com um grupo que é reativo com os grupos hidroxilo, tipicamente anidridos, cloretos de acilo, cloroformatos e carbonatos. Na química de PEGilação de segunda geração, estão disponíveis para a conjugação grupos funcionais mais eficientes, como aldeídos, ésteres, amidas, etc.
As aplicações da PEGilação tornaram-se cada vez mais avançadas e sofisticadas, e aumentou a necessidade de PEGs heterobifuncionais para a conjugação. Estes PEGs heterobifuncionais são muito úteis para ligar duas entidades, onde se necessita de um espaçador hidrófilo, flexível e biocompatível. Os grupos terminais preferidos para os PEGs heterobifuncionais são a maleimida, vinil sulfonas, piridil dissulfureto, aminas, ácidos carboxílicos e ésteres de NHS.
Os agentes de PEGilação de terceira geração, nos quais o polímero foi ramificado, estão disponíveis nas formas de Y ou de pente e apresentam uma viscosidade reduzida e não causam acumulação em órgãos. Recentemente, também foram desenvolvidas estratégias enzimáticas para a PEGilação, ampliando assim as ferramentas de conjugação. Os conjugados PEG-proteína obtidos por métodos enzimáticos já estão em uso clínico, por exemplo: Lipegfilgrastim, Rebinyn ou Esperoct.
Limitações A imprevisibilidade nos tempos de eliminação do organismo dos compostos PEGilados pode causar a acumulação de compostos de elevado peso molecular no fígado originando corpos de inclusão com consequências toxicológicas desconhecidas. Além disso, a alteração no comprimento da cadeia pode causar tempos de eliminação inesperados in vivo. Adicionalmente, as condições experimentais da reação de PEGilação (isto é, pH, temperatura, tempo de reação, custo global do processo e razão molar entre o derivado do PEG e o péptido) também têm um impacto na estabilidade dos produtos finais PEGilados.