Ци́кл трикарбо́новых кисло́т (сокр. ЦТК, цикл Кре́бса, цитра́тный цикл, цикл лимо́нной кислоты́) — центральная часть общего пути катаболизма, циклический биохимический процесс, в ходе которого остатки (СН3СО-) окисляются до диоксида углерода (CO2). При этом за один цикл образуется 2 молекулы CO2, 3 НАДН, 1 ФАДH2 и 1 ГТФ (или АТФ). Электроны, находящиеся на НАДН и ФАДH2, в дальнейшем переносятся на дыхательную цепь, где в ходе реакций окислительного фосфорилирования образуется АТФ.
Цикл трикарбоновых кислот — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме, промежуточный этап между гликолизом и электронтранспортной цепью. Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения, как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.
Цикл превращения лимонной кислоты в живых клетках (то есть цикл трикарбоновых кислот) был открыт и изучен немецким биохимиком Хансом Кребсом, за эту работу он (совместно с Ф. Липманом) был удостоен Нобелевской премии (1953 год).
У эукариот все реакции цикла Кребса протекают внутри митохондрий, а у большинства бактерий реакции цикла протекают в цитозоле.
Общий обзор В начале цикла трикарбоновых кислот ацетил-кофермент А (ацетил-КоА) отдаёт свою ацетильную группу четырёхуглеродному соединению — оксалоацетату (щавелевоуксусной кислоте), при этом образуется шестиуглеродный цитрат (лимонная кислота). Ацетил-КоА является продуктом окисления таких соединений, как глюкоза, аминокислоты и жирные кислоты. Цитрат затем изомеризуется в изоцитрат (изолимонную кислоту), который далее дегидрируется и декарбоксилируется до пятиуглеродной кислоты — α-кетоглутарата. α-Кетоглутарат вновь декарбоксилируется, превращаясь в четырёхуглеродный сукцинат (янтарная кислота). Сукцинат затем в три этапа ферментативно превращается в четырёхуглеродный оксалоацетат, который готов прореагировать с новой молекулой ацетил-КоА. В каждый оборот цикла одна ацетильная группа (то есть два атома углерода) приходит в цикл в виде ацетил-КоА, и два же атома углерода покидают цикл в виде двух молекул CO2; одна молекула оксалоацетата используется для образования цитрата, и одна же впоследствии регенерируется. Оксалоацетат не покидает цикл, и одна молекула оксалоацетата теоретически может связывать неограниченное количество ацетильных групп и, на самом деле, оксалоацетат присутствует в клетках в очень низких концентрациях. Четыре из восьми стадий цикла представляют собой окислительные процессы, выделяющаяся при этих процессах энергия окисления эффективно запасается в виде восстановленных коферментов НАДН и ФАДH2.
Хотя цикл трикарбоновых кислот занимает центральное место в энергетическом метаболизме, его роль не сводится к получению и запасанию энергии. Четырёх- и пятиуглеродные промежуточные соединения цикла служат предшественниками для синтеза многих соединений. Для восполнения этих промежуточных соединений, покинувших цикл, в клетке существуют специальные .
Как упоминалось выше, все реакции цикла трикарбоновых кислот происходят в митохондриях, и в митохондриях же располагается дыхательная цепь (на внутренней мембране). У большей части бактерий ферменты цикла трикарбоновых кислот находятся в цитозоле, а плазматическая мембрана выполняет функции, аналогичные функциям внутренней мембраны митохондрий.
Механизм Цикл трикарбоновых кислот включает 8 основных стадий, которые подробно рассматриваются ниже.
Стадия 1: образование цитрат-иона Первой реакцией цикла является необратимая конденсация ацетил-КоА с оксалоацетатом с образованием цитрата, катализируемая ферментом цитратсинтазой (реакция 1 на общей схеме):
В этой реакции метильная группа в составе ацетильной группы ацетил-КоА присоединяется к карбонильной группе (второму атому углерода, C2-атом) оксалоацетата. В ходе этой реакции в активном центре фермента образуется промежуточное соединение — цитроил-КоА. Оно быстро подвергается гидролизу и расщепляется на свободный КоА и цитрат, которые удаляются из активного центра фермента. Гидролиз этого высокоэнергетичного тиоэфирного промежуточного соединения делает эту реакцию весьма экзергонической. Большое отрицательное изменение стандартной свободной энергии цитратсинтазной реакции необходимо для управления циклом, поскольку, как отмечалось ранее, в норме концентрация оксалоацетата в клетке очень мала. КоА, высвобождаемый при этой реакции, далее участвует в окислительном декарбоксилировании следующей молекулы пирувата при помощи пируватдегидрогеназного комплекса.
Цитратсинтаза была закристаллизована, и был проведён её рентгеноструктурный анализ в присутствии и отсутствии её субстрата и ингибиторов. Каждая субъединица этого гомодимерного фермента представляет собой единый полипептид с двумя доменами, один из которых — крупный и жёсткий, а другой — менее крупный и более пластичный; между этими доменами располагается активный центр фермента. Оксалоацетат — первый из субстратов, связывающихся с цитратсинтазой, — индуцирует значительные конформационные изменения в пластичном домене, создавая сайт связывания для молекулы второго субстрата — ацетил-КоА (см. справа). Когда в активном центре фермента образуется цитроил-КоА, в ферменте происходит второе конформационное изменение, обусловленное гидролизом тиоэфира с высвобождением КоА. Эти изменения конформации, вызванные сначала связыванием с субстратом, потом — промежуточным продуктом, препятствуют преждевременному и непродуктивному разрыву тиоэфирной связи в ацетил-КоА. Кинетические исследования цитратсинтазы подтверждают описанный выше двусубстратный механизм её работы. Вышеописанная цитратсинтазная реакция представляет собой альдольную конденсацию (впрочем, некоторые авторы рассматривают её как конденсацию Клайзена). Ниже представлен механизм цитратсинтазной реакции:
Тиоэфирная связь в ацетил-КоА активирует атомы водорода в метильной группе. Остаток аспартата в активном центре цитратсинтазы отщепляет протон от метильной группы, образуя промежуточное енольное соединение. Это соединение стабилизируется водородной связью и/или остатком гистидина His274 в активном центре фермента. Промежуточное енольное соединение атакует карбонильный атом углерода оксалоацетата, при этом водородная связь с His274 сохраняется. В роли кислоты при атаке оксалоацетата выступает другой остаток гистидина, His320, отдающий оксалоацетату свой протон. В результате конденсации образуется промежуточное соединение цитроил-КоА. Тиоэфирная связь в цитроил-КоА гидролизуется с высвобождением КоА и образованием цитрата.
Стадия 2: образование изоцитрата через цис-аконитат Фермент аконитаза (точнее, аконитатгидратаза) катализирует обратимую изомеризацию цитрата в изоцитрат через образование промежуточного соединения — трикарбоновой кислоты цис-аконитата, которая при этом в норме не покидает активный центр. Аконитаза присоединяет воду по двойной связи связанного с её активным центром цис-аконитата двумя разными способами: в результате одного из них образуется цитрат, в результате другого — изоцитрат (реакции 2 и 3 на общей схеме):
Хотя в равновесной смеси при pH 7,4 и температуре 25 °С содержится менее 10 % изоцитрата, в клетке реакция смещена вправо, поскольку изоцитрат быстро вовлекается в следующую стадию цикла, и его концентрация уменьшается. Аконитаза содержит железосерный кластер, который служит как для связывания субстрата в активном центре, так и для каталитической гидратации или дегидратации. В клетках, не содержащих достаточного количества железа, аконитаза утрачивает свой железосерный кластер и приобретает регуляторную роль в (подробнее см. IRE (биология)). Таким образом, аконитаза является одним из многих ферментов, имеющих две различные функции.
Ниже представлена схема, иллюстрирующая, как железосерный кластер аконитазы связывает изоцитрат и преобразует его в цис-аконитат:
Стадия 3: окисление изоцитрата до α-кетоглутарата В следующей стадии фермент катализирует изоцитрата с образованием α-кетоглутарата (оксоглутарата). Ион Mn2+ (или Mg2+) в активном центре фермента взаимодействует с карбонильной группой промежуточного соединения , который образуется быстро, однако не покидает активного центра до тех пор, пока не декарбоксилируется и не превратится в α-кетоглутарат.
Ниже подробно рассмотрены эти превращения (реакции 4 и 5 на общей схеме):
Изоцитрат окисляется при переносе водорода от изоцитрата на НАД+ или НАДФ+, в зависимости от изозима изоцитратдегидрогеназы (об изозимах см. ниже). В результате окисления образуется оксалосукцинат. Декарбоксилирование оксалосукцината облегчается оттягиванием электронной плотности ионом Mn2+ (или Mg2+). В результате образуется промежуточное енольное соединение. Енольное соединение перестраивается, превращаясь в α-кетоглутарат.
В клетках обнаружены две различных формы (изозима) изоцитратдегидрогеназы. Для функционирования одной из них нужен НАД+, для другой — НАДФ+ (причём для активности последней нужен ион Mg2+, а не Mn2+). Осуществляемые ими реакции в остальном идентичны. У эукариот НАД-зависимый изозим локализован в митохондриальном матриксе и участвует в цикле трикарбоновых кислот. Главной функцией НАДP-зависимого изозима, встречающегося как в митохондриальном матриксе, так и в цитозоле, возможно, является образование НАДФH, который необходим для восстановительных анаболических процессов.
Стадия 4: окисление α-кетоглутарата до сукцинил-КоА В следующей стадии цикла трикарбоновых кислот также происходит окислительное декарбоксилирование, при котором α-кетоглутарат превращается в сукцинил-КоА и СО2 под действием ; в качестве акцептора электронов выступает НАД+, а КоА функционирует как переносчик сукцинильной группы. Энергия окисления α-кетоглутарата запасается при образовании тиоэфирной связи в сукцинил-КоА (реакция 6 на общей схеме):
Эта реакция практически идентична пируватдегидрогеназной реакции окислительного декарбоксилирования пирувата, а α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс чрезвычайно близок к пируватдегидрогеназному комплексу (ПДК) по структуре и функциям. Он включает 3 фермента, гомологичных ферментам E1, E2 и E3 ПДК, и его кофакторами также являются тиаминпирофосфат, липоат, ФАД, НАД и кофермент А. Несомненно, оба комплекса имеют общего эволюционного предка. Хотя ферменты E1 обоих комплексов структурно схожи, их аминокислотные последовательности различаются и, конечно, они специфичны к разным субстратам: E1 комплекса ПДК связывает пируват, а E1 α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса связывает α-кетоглутарат. Ферменты E2 обоих комплексов также очень похожи, и оба ковалентно связываются с липоатом. Субъединицы E3 обоих комплексов идентичны.
Стадия 5: превращение сукцинил-КоА в сукцинат Сукцинил-КоА, как и ацетил-КоА, содержит тиоэфирную связь с большой отрицательной стандартной свободной энергией гидролиза (ΔG′о ≈ −36 кДж/моль). В следующей стадии цикла трикарбоновых кислот энергия, выделяемая при расщеплении тиоэфирной связи, используется на образование в ГТФ или АТФ, при этом сукцинил-КоА превращается в сукцинат (реакция 6 на общей схеме):
Эта обратимая реакция катализируется ферментом (сукцинилтиокиназой); из обоих названий этого фермента следует, что в этой реакции участвует нуклеозидтрифосфат.