thumb|200px|Imaxe xenerada por ordenador d'un modelu de la estructura tridimensional de la enzima purina nucleósido fosforilasa bacteriana.
La cinética enzimática estudia la velocidá de les reacciones químiques que son catalizadas poles enzimes. L'estudiu de la Cinética y Mecanismos de Reacción cinética y de la dinámica química d'una enzima dexa esplicar los detalles del so mecanismu catalíticu, el so papel nel metabolismu, cómo ye controlada la so actividá na célula y cómo pue ser tornada la so actividá por fármacos o venenos o potenciada por otru tipu de molécules.
Les enzimes, na so mayoría, son proteínes cola capacidá de manipoliar otres molécules ensin ser alteriaos pola reacción, eses molécules son denominaes sustratos. Un sustratu ye capaz de xunise al sitiu activu de la enzima que la reconoza y tresformase nun productu a lo llargo d'una serie de pasos denominaos mecanismu enzimáticu. Delles enzimes pueden xunir dellos sustratos distintos y/o lliberar diversos productos, como ye'l casu de les proteases al romper una proteína en dos polipéptidos. N'otros casos, produzse la unión simultánea de dos sustratos, como nel casu de l'ADN polimerasa, que ye capaz d'incorporar un nucleótido (sustratu 1) a una hebra d'ADN (sustratu 2). Anque toos estos mecanismos suelen siguir una complexa serie de pasos, tamién suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidá final de tola reacción. Esta etapa limitante puede consistir nuna reacción química o nun cambéu conformacional de la enzima o del sustratu.
La conocencia adquirida alrodiu de la estructura de les enzimes foi de gran ayuda na visualización ya interpretación de los datos cinéticos. Por casu, la estructura puede suxerir cómo permanecen xuníos sustratu y productu mientres la catálisis, qué cambeos conformacionales asoceden mientres la reacción, o inclusive'l papel en particular de determinaes residuos aminoácidos nel mecanismu catalíticu. Delles enzimes modifiquen la so conformanza significativamente mientres la reacción, y nesi casu, pue ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y ensin sustratu xuníu (suélense usar análogos que se xunen pero nun dexen llevar a cabu la reacción y caltienen a la enzima permanentemente na conformanza de sustratu xuníu).
Los mecanismos enzimáticos pueden ser estremaos en mecanismu d'únicu sustratu o mecanismu de múltiples sustratos. Los estudios cinéticos llevaos a cabu n'enzimes que solo xunen un sustratu, como la triosafosfato isomerasa, pretenden midir l'afinidá cola que se xune'l sustratu y la velocidá cola que lo tresforma en productu. Per otru llau, al estudiar una enzima que xune dellos sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cinética enzimática puede amosar tamién l'orde nel que se xunen los sustratos y l'orde nel que los productos son lliberaos.
Sicasí, non toles catálisis biolóxiques son llevaes a cabu por enzimes proteiques. Esisten molécules catalítiques basaes nel ARN, como les ribozimes y los ribosomes, esenciales pal splicing alternativu y la traducción del ARNm, respeutivamente. La principal diferencia ente les ribozimas y les enzimes anicia nel llindáu númberu de reacciones que pueden llevar a cabu les primeres, anque los sos mecanismos de reacción y les sos cinétiques pueden ser estudiaes y clasificaes polos mesmos métodos.
Principios xenerales thumb|500px|La velocidá de la reacción va aumentando a midida que aumenta la concentración de sustratu hasta que la enzima encher. La reacción química catalizada por una enzima utiliza la mesma cantidá de sustratu y xenera la mesma cantidá de productu qu'una reacción non catalizada. Al igual qu'asocede n'otros tipos de catálisis, les enzimes nun alterien n'absolutu'l equilibriu de la reacción ente sustratu y productu.Ebbing, D.D. Xeneral chemistry La eficiencia de la reacción, hasta'l momentu en que tolos sitios posibles tean ocupaos. Nesi momentu algamaríase'l puntu de saturación de la enzima y, anque s'añader más sustratu, nun va aumentar más la eficiencia de la mesma.
Ensayos enzimáticos
thumb|400px|Curva de progresu d'una reacción enzimática. La rimada representa, nel periodu inicial, la velocidá de la reacción. La zona del pandu representa l'equilibriu de la reacción (nun confundir cola saturación). Un ensayu enzimáticu ye un procedimientu, lleváu a cabu nun llaboratoriu, por aciu el cual puede midise la velocidá d'una reacción enzimática. Como les enzimes nun se peracaben na reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen midir los cambeos esperimentaos bien na concentración de sustratu (que va escayendo), bien na concentración de productu (que va aumentando). Esisten diversos métodos pa realizar estes midíes. La espectrofotometría dexa detectar cambeos na absorbancia de lluz per parte del sustratu o del productu (según la concentración d'estos) y la radiometría implica incorporación o lliberación de radioactividá pa midir la cantidá de productu llográu por tiempu. Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizaos, yá que dexen midir la velocidá de la reacción de forma continua. Otra manera, los ensayos radiométricos requiern retirar les muestres pa midiles, polo que son ensayos discontinuos. Sicasí, estos ensayos son desaxeradamente sensibles y dexen detectar niveles bien baxos d'actividá enzimática.Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) ISBN 0-19-963820-9 Tamién puede utilizase la espectrometría de mases pa detectar la incorporación o lliberación d'isótopos estables cuando'l sustratu ye convertíu en productu. Anguaño esisten métodos senciellos que pueden emplegase con alumnos de bachilleratu como'l propuestu por Johnson R.J. y collaboradores,Johnson, R.J., Hoops, G.C., Savas, C.J., Kartje, Z., Lavis, L.D., A Sensitive and Robust Enzyme Kinetic Experiment Using Microplates and Fluorogenic Ester Substrates. Journal of Chemical Education. 2015; 92 (2), 385-388. quien empleguen hidrolasas de serina y un sustratu fluorogénico. Esti métodu ye rápido, sensible y dexa midir la cinética enzimática, al traviés de la xeneración de fluoresceína como productu.
Los ensayos enzimáticos más sensibles utilicen láseres dirixíos al traviés d'un microscopiu pa reparar los cambeos producíos n'enzimes individuales cuando catalizan una reacción. Estes midíes pueden utilizar cambeos producíos na fluorescencia de cofactores qu'intervienen nel mecanismu de catálisis o bien xunir molécules fluorescentes en llugares específicos de la enzima, que dexen detectar movimientos asocedíos mientres la catálisis.Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141 Estos estudios tán dando una nueva visión de la cinética y la dinámica de les molécules individuales, n'oposición a los estudios de cinética enzimática tradicionales, nos que se repara y mídese el comportamientu d'una población de millones de molécules d'enzima.
Na figura de la derecha puede reparase la típica evolución d'una curva llograda nun ensayu enzimáticu. Primeramente, la enzima tresforma'l sustratu en productu siguiendo un comportamientu llinial. A midida que avanza la reacción, va escosándose la cantidá de sustratu y va menguando la cantidá de productu que se xenera por unidá de tiempu (mengua la velocidá de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica na gráfica. Dependiendo de les condiciones del ensayu y del tipu d'enzima, el periodu inicial puede durar dende milisegundos hasta hores. Los ensayos enzimáticos suelen tar estandarizados por que'l periodu inicial dure alredor de un minutu, pa llevar a cabu les midíes más fácilmente. Sicasí, los modernos equipos d'amiestu rápido de líquidos dexen llevar a cabu midíes cinétiques de periodos iniciales que la so duración puede aportar a inferior a un segundu.Gibson Q.H. Rapid mixing: Stopped flow Methods in Enzymology, (1969) 16:187-228 Esti tipu d'ensayos rápidos son esenciales pa midíes de la cinética del estáu estacionariu, aldericada más embaxo.
La mayoría de los estudios de cinética enzimática centrar nel periodu inicial, esto ye, na zona llinial de la reacción enzimática. Sicasí, tamién ye posible midir tola curva de la reacción y afaer estos datos a una ecuación non llinial. Esta forma de midir les reacciones enzimáticas ye denominada analises de la curva de progresu.Duggleby, R.G. Analysis of enzyme progress curves by non-linear regression. Methods in Enzymology, (1995) 249:61-90. Esti aproximamientu ye bien útil como alternativa a les cinétiques rápides, cuando'l periodu inicial ye demasiáu rápidu pa ser midíu con precisión.
Factores físicu-químicos que pueden modificar l'actividá enzimática Temperatura: les enzimes son sensibles a la temperatura pudiendo trate modificada la so actividá por esti factor. Los rangos de temperatures óptimos pueden llegar a variar sustancialmente d'unes enzimes a otres. De normal, a midida que aumente la temperatura, una enzima va ver amontada la so actividá hasta'l momentu en qu'empiece la desnaturalización de la mesma, que va dar llugar a un amenorgamientu progresivu de dicha actividá. pH: el rangu de pH óptimo tamién ye bien variable ente distintes enzimes. Si'l pH del mediu alloñar del óptimo de la enzima, esta va ver modificada la so carga llétrica al aceptar o donar protones, lo que va modificar la estructura de los aminoácidos y por tanto l'actividá enzimática. Concentración salina: al igual que nos casos enantes mentaos, la concentración de sales del mediu ye crucial pa una óptima actividá enzimática. Una elevada concentración o una ausencia de sales nel mediu pueden torgar l'actividá enzimática, una y bones les enzimes precisen d'una fayadiza concentración d'iones pa caltener la so carga y la so estructura.
Reacciones con un sustratu Les enzimes que presenten un mecanismu d'únicu sustratu inclúin isomerases, tales como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liases intramoleculares, tales como l'adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.Hammann C, Lilley DM. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem. 2002 Aug 2;3(8):690-700. PMID 11779233 Sicasí, esisten ciertes reacciones enzimáticas d'únicu sustratu que nun pertenecen a esta categoría de mecanismos, como ye'l casu de la reacción catalizada pola catalasa. La catalasa reacciona primero con una molécula de peróxidu d'hidróxenu (agua osixenada) y queda nun estáu ferruñosu en lliberando'l productu (agua), y, darréu, ye amenorgada por una segunda molécula de sustratu. Anque mientres la reacción solo participa un sustratu, la esistencia d'un intermediariu enzimáticu modificáu dexa incluyir al mecanismu de la catalasa na categoría de mecanismos de ping-pong, un tipu de mecanismu aldericáu más palantre.
Cinética de Michaelis-Menten
Como les reacciones catalizadas por enzimes son saturables, la velocidá de catálisis nun amuesa un comportamientu llinial nuna gráfica al aumentar la concentración de sustratu. Si la velocidá inicial de la reacción midir a una determinada concentración de sustratu (representáu como ), la velocidá de la reacción (representáu como ) aumenta linealmente col aumentu de la , como puede vese na figura. Sicasí, cuando aumentamos la , la enzima encher de sustratu y algama la so velocidá máxima , que nun va devasar en nengún casu, independientemente de la .
left|thumb|300px|Mecanismu d'unión d'únicu sustratu pa una reacción enzimática. k1, k-1 y k2 son les constantes cinétiques pa caúna de les etapes de la reacción.
El modelu de cinética michaeliana pa una reacción d'únicu sustratu puede vese na figura de la izquierda. De primeres, tien llugar una reacción química bimolecular ente la enzima y el sustratu , formándose'l complexu enzima-sustratu . Anque'l mecanismu enzimáticu pa una reacción unimolecular puede ser bastante complexu, esiste una etapa enzimática limitante que dexa que'l mecanismu seya simplificáu como una etapa cinética única que la so constante ye .
(Ecuación 1)