miniatura|Western blot no que se usa un anticorpo que recoñece proteínas modificadas con ácido lipoico. O western blot (ás veces chamado inmunoblot de proteínas ou transferencia western) é unha técnica analítica moi utilizada para detectar proteínas específicas nunha mostra de homoxeneizado de tecidos ou extracto. Utiliza electroforese en xel para separar as proteínas nativas pola súa estrutura tridimensional ou proteínas desnaturalizadas pola lonxitude da súa cadea polipeptídica. As proteínas son despois transferidas a unha membrana (tipicamente de nitrocelulosa ou PVDF), polo que é unha técnica de blotting ou transferencia. Unha vez na membrana son marcadas con anticorpos específicos para a proteína diana. O paso de electroforese en xel está incluído nas análises de western blot para resolver o problema da reactividade cruzada dos anticorpos.
Hai moitas empresas fornecedoras de reactivos que se especializan en proporcionar anticorpos (monoclonais e policlonais) contra decenas de miles de proteínas diferentes. Os anticorpos comerciais poden ser caros, aínda que o anticorpo non unido pode ser reutilizado en distintos experimentos. Este método úsase nos campos da bioloxía molecular, inmunoxenética e outras disciplinas da bioloxía molecular. Disponse de varios motores de busca, como CiteAb, Antibodypedia, e SeekProducts, que poden axudar aos investigadores a encontrar os anticorpos axeitados para o seu uso no western blot.
Outras técnicas relacionadas son a análise dot blot, a inmunohistoquímica e a inmunocitoquímica, onde se usan anticorpos para detectar proteínas en tecidos e células por inmunomarcaxe, e ensaio inmunoabsorbente de encima ligado (ELISA).
O método orixinouse no laboratorio de Harry Towbin no Friedrich Miescher Institute, en Suíza. O nome western blot deullo a esta técnica W. Neal Burnette facendo un xogo de palabras coa técnica coñecida anteriormente Southern blot e cos puntos cardinais xeográficos, a cal é unha técnica para a detección de ADN desenvolvida por Edwin Southern (o nome procede do seu apelido, polo que Southern blot se escribe con maiúscula). A detección de ARN denomínase northern blot e foi desenvolvida por George Stark na Universidade Stanford, en California. O western blot non é necesario escribilo con maiúscula, xa que non procede dun apelido, pero moitas veces aparece escrito con maiúscula por analoxía coa técnica Southern.
Pasos a seguir
Preparación dos tecidos As mostras poden tomarse de tecidos completos ou de cultivos celulares. Os tecidos sólidos son primeiro desfeitos mecanicamente usando un batedor ou blender (para grandes volumes de mostra), ou utilizando un homoxeneizador (para pequenos volumes), ou por sonicación. Tamén se pode facer romper as células para que vertan o seu contido por algún dos medios mecánicos antes mencionados. Porén, os virus ou as mostras ambientais poden ser a fonte das proteínas estudadas, polo que o western blot non está restrinxido só a estudos de células.
Hai un amplo surtido de deterxentes, sales e tampóns que se poden empregar para favorecer a lise de células e para solubilizar proteínas. A miúdo engádense inhibidores de proteases e fosfatases para impedir a dixestión da mostra polos seus propios encimas. A preparación dos tecidos faise a miúdo a temperaturas frías para evitar a degradación e desnaturalización de proteínas.
Pode utilizarse unha combinación de técnicas bioquímicas e mecánicas, que comprenden varios tipos de filtración e centrifugación, para separar diferentes orgánulos e compartimentos celulares.
center
Electroforese en xel
As proteínas da mostra son separadas utilizando electroforese en xel. A separación de proteínas pode facerse polo punto isoeléctrico (pI), peso molecular, carga eléctrica, ou por unha combinación destes factores. A natureza da separación depende do tratamento da mostra e da natureza do xel. Isto é un modo moi útil para identificar a proteína.
Con diferenza, o tipo máis común de electroforese en xel emprega xeles de poliacrilamida e tampóns cargados con dodecil sulfato sódico (SDS). A SDS-PAGE (electroforese en xel de poliacrilamida SDS) mantén os polipéptidos en estado desnaturalizado unha vez que foron tratados con axentes redutores fortes para desfacer as súas estruturas secundaria e terciaria (por exemplo, os enlaces disulfuro [S-S] pasan a ser grupos sulfhidrilo [SH e SH]), e así permite a separación de proteínas polo seu peso molecular. As proteínas mostreadas quedan cubertas polo SDS cargado negativamente e móvense ao eléctrodo cargado positivamente a través da rede de acrilamida do xel. As proteínas pequenas migran máis rápido a través desta rede e así as proteínas son separadas de acordo co seu tamaño (xeralmente medido en quilodaltons, kDa). A concentración de acrilamida determina a resolución do xel. Canta maior é a concentración de acrilamida, mellor é a resolución das proteínas de peso molecular menor. Canta menor é a concentración de acrilamida, mellor é a resolución das proteínas de maior peso molecular. As proteínas viaxan a través do xel só nunha dimensión na maioría dos blots.
As mostras cárganse en pozos feitos no xel. Unha das pistas ou carreiros do xel resérvase xeralmente para un marcador ou escada, que é unha mestura de proteínas proporcionada comercialmente que teñen pesos moleculares definidos, tinguidos tipicamente para que formen bandas coloreadas visibles. Cando a voltaxe se aplica ao longo do xel, as proteínas migran a través del a diferentes velocidades dependendo do seu tamaño. Estas diferentes velocidades de avance (diferentes mobilidades electroforéticas) fan que se separen en bandas dentro de cada carreiro do xel (no que corren as proteínas).
center
Tamén é posible usar un xel bidimensional (2-D) que fai que as proteínas se espallen desde unha soa mostra en dúas dimensións. As proteínas son separadas de acordo co seu punto isoeléctrico (o pH ao cal a súa carga neta é neutra) na primeira dimensión, e segundo os seus pesos moleculares na segunda dimensión.
Transferencia Para facer que a proteínas sexan accesibles á detección por anticorpos, son retiradas do xel e pasadas a unha membrana de nitrocelulosa ou difluoruro de polivinilideno (PVDF). O método principal de transferencia de proteínas denomínase electroblotting e utiliza unha corrente eléctrica para impulsar as proteínas desde o xel á membrana de PVDF ou nitrocelulosa. As proteínas móvense desde o interior do xel á membrana pero mantendo a organización que tiñan no xel. Un método antigo de transferencia situaba unha membrana na parte superior do xel, e unha morea de papeis de filtro enriba dela. O conxunto completo situábase nunha solución tampón, que ascende polo papel por capilaridade, arrastrando as proteínas con ela. Na práctica este método xa non se usa, xa que leva moito tempo, e prefírese usar o electroblotting. Como resultado de ambos os procesos de "blotting" (transferencia), as proteínas expóñense sobre unha capa superficial fina para a detección (véxase máis abaixo). Ambas as variedades de membrana son elixidas polas súas propiedades de unión non específica a proteínas (é dicir, únense a todas as proteínas igualmente ben). A unión a proteínas está baseada en interaccións hidrofóbicas, e en interaccións cargadas entre a membrana e a proteína. As membranas de nitrocelulosa son máis baratas que as de PVDF, pero son moito máis fráxiles e non resisten ben para usarse en repetidos experimentos.
center
A uniformidade e efectividade global da transferencia de proteínas desde o xel á membrana pode ser comprobada tinguindo a membrana cos colorantes Azul Brillante Coomassie ou Ponceau S. O Ponceau S é o máis común dos dous, debido á súa alta sensibilidade e solubilidade en auga. A súa hidrosolubilidade fai máis doado des-tinguir e sondar seguidamente a membrana, como se describe máis adiante.
Bloqueo Como as membranas foron elixidas pola súa capacidade que teñen de que se unan a elas proteínas, e como os anticorpos e as dianas son proteínas, deben tomarse precaucións para impedir a interacción entre a membrana e o anticorpo para impedir as interaccións entre a membrana e o anticorpo usado para a detección da proteína diana. O bloqueo da unión non específica conséguese situando a membrana nunha solución diluída de proteínas, xeralmente do 3 ao 5% de albumina sérica bovina (BSA) ou leite en po desnatada (ambos baratos) en Tris-Tamponado Salino (TBS, Tris-Buffered Saline) ou I-Block, cunha diminuta porcentaxe (0,1%) de deterxente como Tween 20 ou Triton X-100. A proteína na solución diluída únese á membrana en todos os sitios onde non se uniron as proteínas diana. Así, cando se engade o anticorpo, non hai espazo na membrana para que este se una a outro a non ser sobre os sitios de unión da proteína diana específica. Isto reduce o "ruído" no produto final do western blot, o que orixina resultados máis claros, e elimina os falsos positivos.
Detección
Durante o proceso de detección a membrana é "sondada" para buscar a proteína de interese cun anticorpo modificado, que está ligado a un encima reporteiro; cando se expón a un substrato apropiado, este encima impulsa unha reacción colorimétrica e produce unha cor. Por varias razóns, isto tradicionalmente ten lugar nun proceso en dúas etapas, aínda que hai agora métodos de detección nunha etapa dispoñibles para certas aplicacións.
Método en dúas etapas
Anticorpo primario
Os anticorpos primarios xéranse cando se expón unha especie hóspede ou un cultivo de células inmunitarias á proteína de interese (ou a unha parte dela). Normalmente, esta produción forma parte da resposta inmunitaria, pero aquí os anticorpos van ser recollidos e utilizados como ferramentas de detección específicas e sensibles que se unen á proteína directamente.
Despois do bloqueo, unha solución diluída de anticorpos primarios (xeralmente entre 0,5 e 5 microgramos/mL) incúbase coa membrana e cunha suave axitación. Tipicamente, a solución está composta de solución salina tamponada cunha pequena porcentaxe de deterxente, e ás veces con leite en po e BSA. A solución de anticorpos e a membrana poden selarse e incubarse xuntas durante 30 minutos ou ata toda a noite. Poden tamén ser incubados a diferentes temperaturas, e as temperaturas máis altas están asociadas con maior unión do produto, tanto específica (á proteína diana, o "sinal") coma non específica ("ruído").
Anticorpo secundario
Despois de lavar a membrana para retirar os anticorpos primarios que non se uniron, a membrana é exposta a outro anticorpo, dirixido a unha porción específica de especie do anticorpo primario. Os anticorpos proceden de fontes animais (ou cultivos de hibridomas de orixe animal); un anticorpo secundario de rato vaise unir a case calquera anticorpo primario de rato, o que permite algún aforro no custo ao poder todo o laboratorio compartir unha soa fonte de anticorpos producidos en masa, e proporciona resultados moito máis consistentes. Isto coñécese como anticorpo secundario, e debido ás súas propiedades de unión a produtos concretos, adoita denominarse "anti-rato", "anti-cabra" etc. O anticorpo secundario está xeralmente ligado á biotina ou a un encima reporteiro como a fosfatase alcalina ou a peroxidase de ravo picante (Armoracia rusticana). Isto significa que varios anticorpos secundarios se unen a un anticorpo primario e potencian o sinal.